STANOVENÍ ALLOXANU V MOUCE POMOCÍ KAPILÁRNÍ ELEKTROFORÉZY VE SPOJENÍ S TANDEMOVOU HMOTNOSTNÍ SPEKTROMETRIÍ

Význam tématu

Alloxan je cukrový analog s diabetogenním účinkem, který se může vznikat při bělení mouky a akumulovat v lidských beta-buňkách. Jeho sledování je důležité pro zajištění kvality potravin, prevenci zdravotních rizik a lepší pochopení etiologie diabetu 1. typu.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo navrhnout a optimalizovat metodu stanovení alloxanu v mouce pomocí kapilární elektroforézy spojené s tandemovou hmotnostní spektrometrií (CE-MS) bez nutnosti derivatizace, a ověřit ji na reálných vzorcích bělené i nebělené mouky.

Použitá metodika a instrumentace

• Kapitální elektroforéza Agilent 7100 s tandemovým hmotnostním spektrometrem Agilent 6460 (ESI, trojitý kvadrupól).
• Křemenná kapilára 50 µm/90 cm, kondicionovaná 0,1 M NaOH a vodou.
• Mobilní fáze (BGE): 50 mM amonný acetát pH 9,5; pomocná kapalina voda/methanol (1:1, v/v) 10 µl·min⁻¹.
• Ionizační podmínky ESI: sprejovací napětí –4 kV, teplota 200 °C, fragmentor 80 V (alloxan) a 135 V (močová kyselina).
• Interní standard: močová kyselina (přechod m/z 167→124); alloxan sledován přechodem m/z 159→115.
• Extrakční postup pro mouku: 1 g vzorku, 10 ml deionizované vody, ultrazvuk 10 min, filtr PTFE 0,45 µm.

Hlavní výsledky a diskuse

• MS charakteristika: molekulový ion [M–H]⁻ alloxanu m/z 141, adukt s vodou m/z 159, dekarboxylovaný fragment m/z 115.
• Hydrolýza alloxanu na alloxanovou kyselinu detekovatelná okamžitě i po 48 hodinách, přesto alloxanová kyselina nevykazuje diabetogenní účinek.
• Optimalizace CE-MS vedla k separaci alloxanu a močové kyseliny za 8 min při BGE amonném acetátu pH 9,5 a pom.c. voda/methanol 1:1.
• Metoda dosahuje meze detekce 9,6 µg g⁻¹ mouky.
• Analýza pěti komerčních vzorků (2 polohrubé české, 3 bělené americké) nevykázala přítomnost alloxanu nad mezí detekce.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlou, citlivou a selektivní detekci alloxanu bez derivatizace, vhodnou pro rutinní kontrolu kvality mouky i pro výzkumné účely v oblasti potravinářského i biologického testování.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace na různé potravinářské a biologické matrice (plazma, moč).
• Využití SRM přechodů pro kvantitativní sledování a metabolické dráhy alloxanu.
• Studium rychlosti a podmínek hydrolýzy, tautomerních forem a reaktivních kyslíkových forem.
• Automatizace a vysokopropustné platformy pro screening potravin a klinických vzorků.

Závěr

Byla vyvinuta a ověřena CE-MS metoda pro stanovení alloxanu v mouce s mezí detekce 9,6 µg·g⁻¹ a dobou analýzy 8 min. Aplikace na reálné vzorky ukázala jeho nepřítomnost nad stanovenou mez, což potvrzuje účinnost metody pro QA/QC i výzkum etio­logie diabetu.

Reference

1. Dunn J. S., Sheehan H. L., McLetchie N. G. B.: Lancet 244, 484 (1943).
2. Walde S. S., Dohle C., Schott-Ohly P., Gleichmann H.: Life Sci. 71, 1681 (2002).
3. Lenzen S.: Diabetologia 51, 216 (2008).
4. Dunn J. S., McLetchie N. G. B.: Lancet 245, 384 (1943).
5. Szkudelski T.: Physiol. Res. 50, 536 (2001).
6. Goldner M. G., Gomori G.: Endocrinology 35, 241 (1944).
7. Rohilla A., Shahjad A.: Int. J. Res. Pharm. Biomed. Sci. 3, 819 (2012).
8. Lenzen S., Panten U.: Diabetologia 31, 337 (1988).
9. Eizirik D. L., Pipeleers D. G., Ling Z., Welsh N., Hellerström C., Andersson A.: Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 91, 9253 (1994).
10. Lenzen S.: Diabetologia 51, 216 (2008).
11. Tyrberg B., Andersson A., Borg L. A. H.: Gen. Compar. Endocrinol. 122, 238 (2001).
12. Bolton W.: Acta Crystallogr. 17, 147 (1964).
13. Richardson G. M., Cannan R. K.: J. Biochem. 23, 68 (1929).
14. Archibald R. M.: J. Biol. Chem. 158, 347 (1945).
15. Mrozikiewicz A., Kielczewska-Mrozikiewicz D., Lowicki Z., Chmara E., Korzeniowska K., Mrozikiewicz P. M.: Acta Diabetol. 31, 236 (1994).
16. Murthy A. P., Duraimurugan K., Sridhar J., Madhavan J.: Electrochim. Acta 317, 182 (2019).
17. Papoušek R., Borovcová L., Táborský J., Skopalová J., Barták P.: Advances in Chromatography and Electrophoresis & Chiranal 2016. Book of Abstracts, (Maier V., ed.), 133–134 (2016).
18. Giaccone V., Cammilleri G., Di Stefano V., Pitonzo R., Vella A., Pulvirenti A., Lo Dico G. M., Ferrantelli V., Macaluso A.: J. Cereal Sci. 77, 120 (2017).
19. Fukayama M. Y., Tan H., Wheeler W. B., Wei C. I.: Environ. Health Perspect. 69, 267 (1986).
20. Raghavamenon A., Dupard-Julien C. L., Kandlakunta B., Uppu R. M.: Toxicol. Mech. Methods 19, 498 (2009).
21. Kim K. M., Henderson G. N., Ouyang X., Frye R. F., Sautin Y. Y., Feig D. I., Johnson R. J.: J. Chromatogr. B 877, 2032 (2009).