PROTEOMICKÁ IDENTIFIKACE GLUTENOVÝCH BÍLKOVIN

Význam tématu

Potravinářský význam obilných bílkovin a jejich toxický potenciál pro pacienty s celiakií vyžadují spolehlivé analytické nástroje. Proteomická identifikace umožňuje přímé rozlišení jednotlivých glutenových proteinů navzdory vysoké sekvenciální homologii a omezením imunologických testů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo aplikovat proteomické metody, konkrétně enzymatické štěpení a tandemovou hmotnostní spektrometrii, k jednoznačné identifikaci glutenových bílkovin v ethanolu extrahovaných vzorcích pšeničné mouky. Studie hodnotila vhodnost chymotrypsinu a různé typy MALDI-MS přístrojů.

Použitá metodika

• Extrakce: 60% ethanolu z pšeničné mouky, dvakrát 30 min na třepačce.
• Separace: 1-D SDS-PAGE na 12% tris-glycinovém gelu, barvení Coomassie Blue.
• In-gel digest: redukce DTT, alkylace iodoacetamidem, chymotrypsinové štěpení (37 °C, 18 h).
• Čištění peptidů: ZipTip C18, matrice CHCA a DHB pro MALDI.
• Detekce: MALDI-TOF, MALDI-TOF/TOF a MALDI QIT-TOF se zřetelnou MS/MS analýzou.

Použitá instrumentace

• AXIMA CFR (Shimadzu Biotech Kratos Analytical) – MALDI-TOF s curved field reflektronem.
• 4700 Proteomics Analyzer (Applied Biosystems) – MALDI-TOF/TOF.
• AXIMA QIT (Shimadzu Biotech Kratos Analytical) – MALDI QIT-TOF.
• ZipTip C18 (Millipore), SDS-PAGE systém NOVEX (Invitrogen).

Hlavní výsledky a diskuse

Proteomický přístup identifikoval HMW glutenin subunit DX5 a α-gliadin u vybraných gelových pásů. Chymotrypsinové štěpení poskytlo vhodné peptidy pro MS/MS, zatímco standardní peptide mass fingerprinting selhal kvůli vysoké homologii. Tandemová MS umožnila vyčíst části sekvence z fragmentačních spekter na MALDI QIT-TOF a MALDI-TOF/TOF.

Přínosy a praktické využití metody

Proteomická identifikace glutenových proteinů nabízí spolehlivou alternativu k ELISA a immunoblottingu s nižší pravděpodobností falešných výsledků. Metoda může sloužit pro rutinní QA/QC v potravinářském průmyslu a sledování toxických glutenových peptidů.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na 2-D PAGE nebo LC-MALDI pro lepší rozlišení komplexních vzorků.
• Kvantitativní řídící přístupy (MRM/SRM) ke stanovení obsahu glutenů.
• Využití dalších proteáz pro rozšíření sekvenční pokrytí.
• Aplikace na ostatní obiloviny (ječmen, žito, oves) a potravinové matrix.

Závěr

Proteomická analýza s použitím chymotrypsinového štěpení a tandemové MALDI-MS poskytuje jednoznačnou identifikaci glutenových bílkovin, překonává omezení imunologických metod a nabízí perspektivu pro spolehlivou kontrolu potravin určených pro pacienty s celiakií.

Reference

1. Camafeita E., Alfonso P., Acevedo B., Méndez E.: J. Mass Spectrom. 32, 444 (1997).
2. Camafeita E., Solís J., Alfonso P., López J. A., Sorell L., Méndez E.: J. Chromatogr., A 823, 299 (1998).
3. Matuz J., Póka R., Boldizsár I., Szerdahelzi E., Hajós G.: Cereal Res. Commun. 28, 433 (2000).
4. Novák P., Man P., Tučková L., Tlaskalová-Hogenová H., Bezouška K., Havlíček V.: J. Mass Spectrom. 37, 507 (2002).
5. Singh H., Case S., Duerksen D.: Clin. Nutr. Rounds 3 (2003).
6. Koning F.: J. Mol. Recognit. 16, 333 (2003).
7. Jennings J. S. R., Howdle P. D.: Curr. Opin. Gastroenterol. 19, 118 (2003).
8. Gellrich C., Schieberle P., Wieser H.: Cereal Chem. 80, 102 (2003).
9. Garozzo D., Cozzolino R., Giorgi S. D., Fisichella S., Lafiandra D.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 13, 2084 (1999).
10. Masci S., D’Ovidio R., Lafiandra D., Kasarda D. D.: Plant Physiol. 118, 1147 (1998).
11. Masci S., Egorov T. A., Ronchi C., Kuzmicky D. D., Kasarda D. D., Lafiandra D.: J. Cereal Sci. 29, 17 (1999).
12. Méndez E., Camafeita E., Sebastián J. S., Valle I., Solís J., Mayer-Posner F. J., Suckau D., Marfisi C., Soriano F.: J. Mass Spectrom. S123 (1995).
13. Dworschak R. G., Ens W., Standing K. G., Preston K. R., Marchylo B. A., Nightingale M. J., Stevenson S. G., Hatcher D. W.: J. Mass Spectrom. 33, 429 (1998).
14. Cunsolo V., Foti S., Saletti R., Gilbert S., Tatham A. S., Shewry P. R.: J. Mass Spectrom. 39, 66 (2004).
15. Sorell L., López J. A., Valdés I., Alfonso P., Camafeita E., Acevedo B., Chirdo F., Gavilondo J., Méndez E.: FEBS Lett. 439, 46 (1998).
16. Denery-Papini S., Nicolas Y., Popineau Y.: J. Cereal Sci. 30, 121 (1999).
17. Rocher A., Calero M., Soriano E., Méndez E.: Biochim. Biophys. Acta 295, 13 (1996).
18. Camafeita E., Alfonso P., Mothes T., Méndez E.: J. Mass Spectrom. 32, 940 (1997).
19. Camafeita E., Méndez E.: J. Mass Spectrom. 33, 1023 (1998).
20. McComb M. E., Oleschuk R. D., Chow A., Perreault H., Dworschak R. G., Znamirowski M., Ens W., Standing K. G., Preston K. R.: Can. J. Chem. 79, 437 (2001).
21. Hernando A., Valdes I., Méndez E.: J. Mass Spectrom. 38, 862 (2003).
22. Chmelík J., Řehulka P., Mayrhofer C., Allmaier G.: Kvasný Prům. 47, 159 (2001).
23. Chmelík J., Řehulka P., Střelcová M., Kubáň V., Mayrhofer C., Allmaier G.: Rostl. Výroba 48, 261 (2002).
24. Řehulka P., Šalplachta J., Chmelík J.: J. Mass Spectrom. 38, 1267 (2003).
25. Šalplachta J., Řehulka P., Chmelík J.: J. Mass Spectrom. 39, 1395 (2004).
26. Shevchenko A., Wilm M., Vorm O., Mann M.: Anal. Chem. 68, 850 (1996).