METODA PRO ANALÝZU ISOPROSTANŮ VE TKÁNI LOSOSA

Význam tématu

Isoprostany představují spolehlivé markery oxidačního stresu vznikající neenzymatickou peroxidací polynenasycených mastných kyselin. Monitorování jejich hladiny v biologických tkáních, například u lososů postižených syndromem M74, je klíčové pro hodnocení environmentálních rizik a biologické kondice organismu.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat citlivou a selektivní metodiku pro stanovení vybraných izomerů isoprostanu typu iPF2α (III, IV a VI) ve tkáni lososa (Salmo salar). Studie zahrnovala optimalizaci podmínek alkalické hydrolýzy, extrakce tuhou fází (SPE) a chromatografických a spektrometrických parametrů UPLC-MS/MS analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorek lososí tkáně (ca 350 mg) byl alkalicky hydrolyzován 1 M KOH při 39 °C s přídavkem BHT jako antioxidantem, následně acidifikován HCl a mravenčí kyselinou a přečištěn na polymerní SPE kolonce Strata-X 200 mg/3 mL (Phenomenex). Isoprostany byly eluovány methanolem, koncentrovány pod dusíkovým proudem a připraveny pro analýzu.
Chromatografické rozdělení proběhlo na UPLC Acquity BEH C18 kolonce (50 × 2,1 mm, 1,7 μm) s mobilními fázemi A: 0,1 % kyselina octová ve vodě a B: 0,1 % kyselina octová v methanolu. Detekce využívala hmotnostní spektrometr Xevo TQ MS (Waters) s ionizací ESI v negativním modu a MRM přechody 353→155 (iPF2α-III), 353→127 (iPF2α-IV) a 353→115 (iPF2α-VI).

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace kolizní energie přinesla maximální odezvy při 25 eV (III), 23 eV (IV) a 19 eV (VI). Mobilní fáze s 0,1 % kyselinou octovou vykázala až dvojnásobné zvýšení ploch píků oproti formátové nebo amonně modifikované fázi. SPE polymerní kolonka dosahovala průměrných výtěžností ~99 %. Metoda prokázala linearitu v rozsahu 0,1–100 ng·mL⁻¹ (R² > 0,999), LOD 0,009–0,026 ng·g⁻¹ a LOQ 0,028–0,085 ng·g⁻¹, s opakovatelností RSD 9,9–14,7 %.

Přínosy a praktické využití metody

Navržená metodika umožňuje simultánní kvantifikaci více izomerů isoprostanu bez nutnosti derivatizace, s vysokou citlivostí a selektivitou. Je vhodná pro studie oxidačního stresu v environmentálních, biologických i medicínských vzorcích a pro hodnocení vlivu stresorů na vodní organismy.

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit na další třídy isoprostanu, další tkáňové a biologické matrice a integrovat do ne-cíleného profilování oxidativních produktů pomocí vysokorozlišovací hmotnostní spektrometrie. Perspektivní je také automatizace přípravy vzorků a aplikace v průmyslové QA/QC laboratorní praxi.

Závěr

Vyvinutá UPLC-MS/MS metoda pro analýzu isoprostanů ve tkáni lososa se vyznačuje vysokou citlivostí, selektivitou a reprodukovatelností. Díky absenci derivatizace a účinnému SPE čištění je plně přenosná pro rutinní stanovení markerů oxidačního stresu v různých biologických vzorcích.

Reference

• Morrow JD et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90, 9383 (1990)
• Sicilia T et al. J. Chromatogr. B 861, 48 (2008)
• Li H et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 13381 (1999)
• Montuschi P et al. Inflamm. Res. 52, 502 (2003)
• Masoodi M, Nicolaou A. Rapid Commun. Mass Spectrom. 20, 3023 (2006)
• Toyo’oka T et al. Biomed. Chromatogr. 6, 143 (1992)
• Ritov VB et al. Anal. Biochem. 311, 10 (2002)
• Lee C-YJ et al. Biochem. Biophys. Res. Commun. 320, 696 (2004)
• Tsikas D. J. Chromatogr. B 717, 201 (1998)