VYUŽITÍ METODY UHPLC-ESI/MS/MS PRO STANOVENÍ POLYFENOLICKÝCH LÁTEK TYPU STILBENŮ

Význam tématu

Polyfenolické látky typu stilbenů, zejména resveratrol a jeho glukosid piceid, vykazují významné biologické účinky, například antioxidační, protizánětlivé a prevenci karcinogeneze. Jejich určování ve vedlejších produktech vinohradnictví, jako jsou pokrutiny po lisování hroznových semen, přispívá k jejich hodnocení jako potenciálního zdroje bioaktivních látek pro farmaceutický, potravinářský či krmný průmysl.

Cíle studie

Cílem práce bylo vyvinout a validovat citlivou a selektivní metodu UHPLC–ESI/MS/MS pro kvantifikaci cis- a trans-resveratrolu a cis- a trans-piceidu v pokrutinách vzniklých po extrakci oleje z hroznů. Dále bylo sledováno ovlivnění obsahu analyzovaných látek odrůdou, lokalitou pěstování (Mělník vs. Praha-Grébovka) a ročníkem sklizně (2012 a 2013).

Použitá instrumentace

• UHPLC systém UltiMate 3000 RS (Thermo Fisher Scientific)
• Analytická kolona Pinnacle DB C18 (50 × 2,1 mm, 1,9 µm; Restek)
• Hybridní tandemový hmotnostní spektrometr 3200 QTRAP (AB Sciex) se zdrojem ESI v negativním módu
• Ultrazvuková lázeň a centrifuga Eppendorf 5810R
• Vakuová rotační odparka Buchi

Použitá metodika

Pro extrakci 0,2 g suchého vzorku pokrutin byla použita směs methanol:ethylacetát (1:1), probíhalo třístupňové macerování, ultrazvukové ošetření a centrifugace. Suché extrakty se rozpuštěním v methanolu podrobily UHPLC–ESI/MS/MS analýze. Chromatografické podmínky zahrnovaly gradient acetonitrilu a 0,1% kyseliny octové při průtoku 0,35 ml/min, doba analýzy 9 min. Kvantifikace probíhala externí kalibrací standardů trans-resveratrolu a trans-piceidu a jejich UV-indukovanou přeměnou na cis-formy. Limity detekce se pohybovaly od 0,001 do 0,003 µg/ml, limity kvantifikace od 0,003 do 0,009 µg/ml.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýzy pokrutin ze šesti modrých a tří bílých odrůd prokázaly, že:

• Nejvyšší obsahy trans-resveratrolu vykazovala odrůda Rulandské modré (24,4 µg/g sušiny v roce 2013) a Zweigeltrebe (15,4 µg/g v roce 2012).
• Obsahy cis-resveratrolu byly v rozmezí 0,06–6,43 µg/g sušiny, s výrazně vyššími hodnotami v roce 2013.
• Trans-piceid dosahoval nejvyššího obsahu u Hibernalu (3,97 µg/g), cis-piceid u Dornfelderu (2,49 µg/g) v roce 2013.
• Odrůda, lokalita i průběh ročníku (sušší 2012 vs. vlhčí 2013) významně ovlivnily koncentrace sledovaných látek.

Přínosy a praktické využití metody

Vyvinutá UHPLC–ESI/MS/MS metoda umožňuje rychlé a spolehlivé stanovení nízkých koncentrací cis/trans-resveratrolu a piceidu ve vinohradnickém odpadu. Umožňuje tak efektivní využití pokrutin jako zdroje bioaktivních polyfenolů pro výrobu nutraceutik, farmaceutik či krmiv pro hospodářská zvířata.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření metodiky na další deriváty stilbenů a oligomerické formy resveratrolu.
• Optimalizace extrakčních postupů a škálování procesu pro průmyslové využití.
• Hodnocení biologické aktivity izolovaných frakcí v in vitro a in vivo studiích.
• Využití vedlejších produktů vinohradnictví v agro-a potravinářské výrobě s ohledem na udržitelný rozvoj.

Závěr

Optimalizovaná UHPLC–ESI/MS/MS metoda prokázala vysokou citlivost a reprodukovatelnost v detekci cis- a trans-resveratrolu i piceidu v pokrutinách po lisování semínek révy vinné. Výsledky ukázaly odrůdové, geografické a ročníkové rozdíly v obsahu těchto látek, potvrzující perspektivu využití pokrutin jako cenného zdroje bioaktivních polyfenolů.

Reference

1. Harmatha J.: Chemické listy 99, 622 (2005).
2. Parr A. J., Bolwell G. P.: J. Sci. Food Agr. 80, 985 (2000).
3. Zloch Z.: Vojenské zdravotnické listy 5, 226 (2003).
4. Šmidrkal J. a kol.: Chemické listy 95, 602 (2001).
5. Melzoch K. a kol.: Agric. Conspec. Sci. 66, 53 (2001).
6. Lachman J. a kol.: Hort. Sci. (Prague) 31, 63 (2004).
7. Faitová K. a kol.: Czech J. Food Sci. 22, 215 (2004).
8. Rayne S., Karacabey E., Mazza G.: Ind. Crops Prod. 2008, 335.
9. Liu C. a kol.: Food Chem. 136, 643 (2013).
10. ICH Q2B: Guideline on the Validation of Analytical Procedures: Methodology, Geneva (1996).