STANOVENÍ NIKOTINOVÉ KYSELINY A JEJÍCH METABOLITŮ POMOCÍ HPLC-MS/MS

Význam tématu

Nikotinová kyselina (niacin) je klíčovým kofaktorem v redoxních reakcích energetického metabolismu a prekurzorem NAD/NADP. Ve farmakologii slouží jako účinné hypolipidemikum, avšak uvolňování metabolitů může vést k hepatotoxicitě a dalším nežádoucím účinkům. Přesné stanovení niacinu a jeho metabolitů v biologických vzorcích je zásadní pro hodnocení farmakokinetiky, bezpečnostní monitoring i nutriční status.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a validovat metodiku pro simultánní stanovení nikotinové kyseliny a šesti hlavních metabolitů (nikotinamidu, nikotinamid-N-oxidu, nikotinurové kyseliny, 1-methylnikotinamidu, N-methyl-2-pyridonu-5-karboxamidu a N-methyl-4-pyridonu-5-karboxamidu) v lidské plazmě a moči za pomoci HPLC-MS/MS.

Použitá instrumentace

• Kapalinový chromatograf Thermo Scientific Dionex 3000 (kvartérní pumpa, autosampler, termostat kolony)
• Hmotnostní spektrometr TSQ Quantum Access Max (Thermo Scientific) se zdrojem HESI-II
• SPE kolony Oasis MCX (Waters) pro extrakci biologických vzorků
• Chromatografické kolony: Kinetex C18, Hypercarb, Hypersil Silica

Použitá metodika

Biologické vzorky (plazma, moč) se připravují extrakcí na kartáčích Oasis MCX, eluovány amoniakálními roztoky v organickém rozpouštědle, koncentrovány a rekonstituovány v acetonitrilu/methanolu. Chromatografie probíhá na kolonu Hypercarb nebo Hypersil Silica s gradientem acetonitril-voda obsahující kyselinu mravenčí (0,2–0,75 %). Teplota kolony 40–45 °C, průtok 0,4 ml/min, nástřik 5–15 µl. Detekce v SRM módu s optimalizovanými přechody a kolizními energiemi.

Hlavní výsledky a diskuse

• Kolona Hypercarb: dobré rozlišení většiny metabolitů, avšak izobarické 2-pyr/4-pyr mírně koelují; mrtvý čas kolony blízko MNA.
• Kolona Hypersil Silica: oddělení všech analyzátů, menší asymetrie píků, lineární kalibrace 20–4000 ng/ml pro všechny kromě MNA (kvadratická závislost).
• Optimum gradientu a přídavek kyseliny mravenčí zlepšily rozlišení, symetrii píků a snížily LOQ (2–60 ng/ml).
• Kalibrace v plazmě a moči potvrdila extrakční výtěžnost 75–110 % a RSD < 10 % pro většinu koncentrací.
• Preciznost analýzy plazmatických vzorků od pacientů byla na úrovni RSD 0,06–19,97 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí rychlé a selektivní stanovení niacinu a jeho metabolitů s nízkými meze detekce, vhodné pro PK/PD studie, monitoring hepatotoxicity i sledování nutričního deficitu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Použití izotopicky značených standardů ke kompenzaci matrix efektu a zvýšení přesnosti.
• Automatizace přípravy vzorků na SPE destičkách s vyšším throughputem.
• Rozšíření metody o další konjugované metabolity (glukuronidy, sulfonáty).
• Integrace s dalšími technikami (NMR, kapilární elektroforéza) pro komplexní metabolomiku.

Závěr

Vyvinutá HPLC-MS/MS metoda na bázi SPE extrakce a separace na Hypersil Silica byla validována s požadovanou citlivostí, linearitou a reprodukovatelností pro analýzu niacinu a šesti metabolitů v lidské plazmě a moči. Metoda je robustní a aplikovatelná v klinických i výzkumných laboratořích.

Reference

• Žák A. et al.: Čas. Lék. Česk. 145, 825 (2006).
• Carlson L. A.: J. Intern. Med. 258, 94 (2005).
• Kamanna V. S. et al.: Int. J. Clin. Pract. 63, 1369 (2009).
• Stern R. H.: J. Clin. Lipidol. 1, 191 (2007).
• Li A. C. et al.: Chromatographia 58, 723 (2003).
• Inamadugu J. K. et al.: Biomed. Chromatogr. 24, 1059 (2010).
• Szafarz M. et al.: J. Chromatogr. B 878, 895 (2010).
• Pfuhl P. et al.: J. Pharm. Biomed. Anal. 36, 1045 (2005).
• Hsieh Y., Chen J.: Rapid Commun. Mass Spectrom. 19, 3031 (2005).
• Catz P. et al.: J. Chromatogr. B 829, 123 (2005).