STANOVENÍ 4-HYDROXYMETHAMFETAMINU, 4-HYDROXYAMFETAMINU, AMFETAMINU A METHAMFETAMINU POMOCÍ HPLC S FLUORESCENČNÍ DETEKCÍ

Význam tématu

Stanovení methamfetaminu (MA), amfetaminu (AP) a jejich 4-hydroxy derivátů je klíčové pro toxikologii, forenzní vědy a klinickou diagnostiku. Díky nízké absorpci ve UV oblasti vyžadují tyto látky citlivé detekční techniky. Vývoj cenově dostupné alternativy k LC–MS metodám může výrazně usnadnit rutinní analýzy v laboratořích s omezenými rozpočty.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo vyvinout a validovat rychlou a spolehlivou HPLC metodu s fluorescenční detekcí pro separaci a kvantifikaci MA, AP, p-OHMA a p-OHAP v moči. Článek popisuje optimalizaci chromatografických podmínek, předúpravu vzorku a validační parametry metody.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky moči byly upraveny mikroskopickou extrakcí na pevné fázi (SPE) spojenou s derivatizací DNS-Cl. Pro separaci byla použita kolona LiChrospher 100 RP-18 (125×4 mm, 5 μm) v HPLC přístroji Shimadzu (pumpa LC-10 ADVP, autosampler SIL-10ADVP, termostat CTO-10ASVP, degasser DGU-14A, detektor FL RF-10AXL). Fluorescenční detekce probíhala při λex=343 nm a λem=530 nm. Mobilní fáze: acetonitril–voda (65:35, v/v), průtok 1,0 ml/min, teplota kolony 30 °C, vstřik 20 μl.

Hlavní výsledky a diskuse

Optimalizace prokázala, že nejlepší rozlišení zajišťuje poměr mobilní fáze 65:35 a průtok 1,0 ml/min. Derivatizace při 75 °C po 10 minutách dosahuje maxima výtěžku, zatímco vyšší teploty vedou k problémům s reproducibilitou. Metoda vykazuje limity detekce 1–5 ng/ml a kvantifikace 3–15 ng/ml, linearitu v rozsahu LOQ až 500 ng/ml (MA, AP) či 100 ng/ml (p-OHAP, p-OHMA) a výtěžnosti 60–96 %. Opakovatelnost (RSD ≤11 %) a reprodukovatelnost (RSD ≤16 %) byly v klinicky přijatelné úrovni. Selektivita byla potvrzena analýzou blanku moči bez interferencí.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda kombinuje jednoduchou SPE extrakci s rychlou derivatizací, čímž zkracuje čas přípravy vzorku na 10 minut. Dosahuje vysoké citlivosti srovnatelné či lepší než některé LC–MS metody, je ekonomicky nenáročná a vhodná pro rutinní analýzy v toxikologických a forenzních laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další miniaturizace a automatizace přípravy vzorků, rozšíření aplikace na další biologické matrice (plazma, sérum, sliny) a případné kombinace s hmotnostní detekcí pro zvýšení selektivity. Vývoj nových derivatizačních činidel by mohl dále zvýšit citlivost a zkrátit dobu přípravy.

Závěr

Popsaná HPLC metoda s fluorescenční detekcí poskytuje rychlý, citlivý a cenově efektivní nástroj pro analytiku methamfetaminu, amfetaminu a jejich hydroxy derivátů v moči. Validace prokázala vhodnost pro kvantitativní rutinní stanovení v klinické a forenzní praxi.

Reference

1. Bečková I., Višňovský P., Fisherová M. Farmakologie drogových závislostí. Karolinum, Praha 1999.
2. Riedl O. et al. Klinická toxikologie. Avicenum, Praha 1980.
3. Sato M. Psychopharmacol. Bull. 1986, 22, 751.
4. Endo M. et al. J. Chromatogr. 1980, 196, 334.
5. Chou Ch-Ch., Lee M-R. Anal. Chim. Acta. 2005, 538, 45.
6. Katagi M. et al. J. Chromatogr. B. 1996, 676, 35.
7. Kudo K. et al. Anal. Chim. Acta. 2003, 492, 83.
8. Lua A.C. et al. Anal. Chim. Acta. 2006, 576, 50.
9. Miki A. et al. Proc. Pharm. Soc. Japan 2001, 4, 171.
10. Herráez-Hernández R. et al. Chromatographia. 1999, 49, 266.
11. Wang T.K., Fuh M.S. J. Chromatogr. B. 1996, 686, 285.
12. Faist V. et al. Int. Dairy J. 2000, 10, 339.
13. Kang X. et al. Clin. Chim. Acta. 2006, 366, 352.
14. Maraschiello C. et al. J. Chromatogr. B. 2003, 791, 1.
15. Zhang L. et al. J. Chromatogr. B. 2007, 857, 130.
16. Meng L. et al. Forensic Sci. Int. 2011, 209, 42.
17. Mancinelli R. et al. J. Chromatogr. B. 1999, 735, 243.
18. Concheiro M. et al. Forensic Sci. Int. 2005, 150, 221.