Při instalaci kapilární GC kolony je pro bezproblémový provoz nezbytné provést její přesné připojení. V tomto technickém tipu poskytujeme rady, jak toho nejlépe dosáhnout.<blockquote>Poznámka: U uživatelů s citlivými detektory, jako jsou MS a ECD, je třeba před instalací kolony provést kroky pro kondicionování kolony, aby se zabránilo kontaminaci a časté údržbě detektoru.</blockquote>1) Přes konec kolony nasaďte matici (nut) a feruli a jeden až dva centimetry z konce kolony odřízněte. Ujistěte se, že má ferule správnou velikost a směřuje správným směrem. Zkontrolujte řez lupou a ujistěte se, že je rovný a hladký. Viz obrázek níže. V případě potřeby řez opakujte.2) Vložte výstupní konec kolony do detektoru přesně ve vzdálenosti předepsané v návodu k přístroji. Vzdálenosti se u jednotlivých detektorů liší. Utáhněte matici nejprve rukou a poté o 1/2 otáčky klíčem. Pokud se kolona stále pohybuje, utáhněte ji o další 1/4 otáčky, dokud nebude pevně uchycena.3) Zkontrolujte těsnost spojů kolony pomocí elektronického detektoru úniku. Úniky na vstupním konci mohou způsobit vniknutí kyslíku do kolony, což povede ke zvýšenému krvácení kolony a poškození fáze.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_Gas_Chromatography_GC_Column_Installation_Detector_Installation_813b4d81a0.jpg" alt="Phenomenex: Instalace kolony pro plynovou chromatografii (GC) – instalace do detektoru: Správně a špatně provedený řez GC kapilární kolony" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_Gas_Chromatography_GC_Column_Installation_Detector_Installation_813b4d81a0.jpg 245w," sizes="100vw" width="877" height="242">

Instalace kolony pro plynovou chromatografii (GC) – instalace do detektoru

Gradientová eluce v HPLC je skvělým nástrojem pro analýzu vzorků, jejichž analyty vykazují široké rozpětí retenčních sil na stacionární fázi zvolené chromatografické kolony. Gradienty však nemusí být vždy ideální z hlediska použití pufrů, zejména pokud se snažíme udržet specifickou hodnotu pH. Pokud je pufr omezen pouze na vodnou mobilní fázi a organická mobilní fáze zůstává čistým organickým rozpouštědlem, může gradient narážet na omezení v rozpustnosti a kolísání pufrační kapacity s rostoucím podílem organické fáze během průběhu gradientu. Tuto nevýhodu lze překonat rovnoměrným rozdělením pufru do obou mobilních fází („slabé“ i „silné“), jak si dále ukážeme na přístupech a příkladech.&nbsp;Co třeba přidat do obou mobilních fází kyselé nebo zásadité aditivum, například 0,1 % (v/v) kyseliny mravenčí (HCO₂H)?&nbsp;Takový přídavek do obou fází může pomoci udržet konzistentní koncentraci aditiva v celkové mobilní fázi během změny poměru mezi „slabou“ a „silnou“ mobilní fází. Nevýhodou tohoto přístupu je však volatilita aditiva, která může způsobit nestabilní protonaci či deprotonaci analytů. A někteří z nás si jistě přiznají, že ne vždy připravujeme (v/v) přídavky zcela přesně. Alternativně lze použít vhodný pufr s odpovídající solí pro konkrétní aditivum, který udrží stálé pH, při kterém je připraven, bez rizika odpařování aditiva.Pufry na bázi mravenčanu amonného (NH₄HCO₂) nebo acetátu amonného (NH₄CH₃CO₂) jsou pro gradientovou eluci nejvhodnější, protože jsou dobře rozpustné v methanolu, zatímco jejich vodné pufry lze mísit i s vysokými poměry acetonitrilu. Potřebná pufrační kapacita bývá zpravidla 5–10 mM v každé fázi. Pro srovnání: při izokratické eluci s mobilní fází 60:40 (20 mM pufr:acetonitril) je výsledná koncentrace pufru pouze 12 mM. Obr. 1 znázorňuje analýzu mykotoxinů na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1514">Kinetex™ Bifenyl</a> s 5 mM pufrem acetátu amonného obsaženým ve vodné i methanolové fázi – acetát amonný byl přímo rozpuštěn v methanolu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 1 – Analýza mykotoxinů na Kinetex Biphenyl (ID aplikace 21951)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_3_788ba526cf.jpg 245w," sizes="100vw" width="904" height="475">Při použití acetonitrilu je třeba jej míchat s vodným pufrem, aby byla zachována rozpustnost pufrovací soli. &nbsp;Obr. 2 znázorňuje HILIC analýzu nederivatizovaných aminokyselin na koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products/1542">Biozen™ Glycan</a>, kde byl zásobní pufr (100 mM mravenčan amonný, pH 3,1) přidán do vody i do acetonitrilu v poměru 9:1 (rozpouštědlo:pufr). Výsledná koncentrace pufru v obou fázích byla 10 mM, což udrželo konzistentní pufrační sílu v průběhu gradientu.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 2 – Nederivatizované aminokyseliny na bioZen Glycan (technická poznámka 1264)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_2_bb25c9ae6a.jpg 245w," sizes="100vw" width="987" height="486">Fluorid amonný (NH₄F) se často přidává v malém množství (0,1–0,2 mM) do mobilní fáze pro dosažení vysoce citlivých fluoridových aduktů [M+F]⁻ v režimu ESI⁻ nebo pro podporu tvorby iontů [M+H]⁺ nebo [M+NH₄]⁺ v ESI⁺ režimu. Obr. 3 znázorňuje použití třetího rozpouštědlového kanálu, kterým je 1 mM NH₄F dodáván v konstantním poměru 10 % do celkové mobilní fáze, čímž je zajištěna stálá koncentrace 0,1 mM v celém gradientu. Tato metoda je umožněna ternárními nebo kvarterními pumpami, přičemž se doporučuje izokratické zdržení na začátku metody kvůli lepší přenositelnosti metody mezi různými přístroji. Takové gradienty jsou totiž ovlivněny tzv. „dwell volume“, specifickým pro každý HPLC systém, a to i tehdy, pokud je jedno z rozpouštědel dávkováno konstantně.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg" alt="Phenomenex: Vliv gradientu na pufrační kapacitu: Obrázek 3 – Mikrocystiny na Luna Omega Polar C18 (ID aplikace 23568)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_effects_of_gradient_on_buffer_capacity_dd2c7475e7.jpg 245w," sizes="100vw" width="1071" height="550">Dejte si pozor na rozpustnost pufrů, pokud chcete do gradientu zařadit pufry jako hydrogenuhličitan amonný nebo fosfátové pufry, zejména právě fosfátové. Při vyšším obsahu organického rozpouštědla může dojít k precipitaci a doporučuje se nejprve provést studii rozpustnosti. A nakonec – nezapomeňte zahrnout použitý pufr také do ředicího roztoku vzorku, aby bylo pH sladěno s mobilní fází. To zlepší tvar píků i reprodukovatelnost. Gradientová eluce, u níž je udržována konstantní pufrační síla a hodnota pH, významně zvyšuje spolehlivost HPLC metody.

Vliv gradientu na pufrační kapacitu

Normal phase SPE (extrakce na normální fázi) využívá polární interakce jako retenční mechanismus. Tyto interakce zahrnují vodíkové vazby, dipól-dipól interakce, indukovaný dipól, π-π interakce atd. Dochází k nim mezi polárními funkčními skupinami analytů a polárními sorbenty.Reversed phase SPE (extrakce na reverzní fázi) využívá nepolární, hydrofobní interakce. Tyto interakce zahrnují Van der Waalsovy síly, disperzní síly (Londonovy síly), π-π interakce atd. Probíhají mezi uhlovodíkovými, hydrofobními částmi analytů i sorbentu.Při práci s matricemi vzorků rozpustnými pouze v organických rozpouštědlech se obvykle volí metoda na normální fázi. Příklady takových matric jsou oleje, tuky nebo máslo.V ideálním případě se vzorek před nanesením na sorbent naředí nepolárním rozpouštědlem (např. hexanem). Poté může být promyt hexanem nebo 5% dichlormethanem v hexanu (analogicky k promývání 5% MeOH ve vodě v metodách reverzní fáze za účelem odstranění interferencí matrice). Eluce se následně provádí polárním rozpouštědlem, které přeruší polární interakce mezi analytem a sorbentem.Frakcionace může být provedena použitím rozpouštědel v pořadí rostoucí polarity, nebo směsí rozpouštědel s různou polaritou.Níže je uveden stručný přehled rozpouštědel podle vzrůstající polarity, používaných při SPE na normální fázi:<h3>Rozpouštědla podle polarity</h3>Od nízké po vysokou polaritu:<ul><li>Hexan</li><li>Isooktan</li><li>Tetrachlormethan</li><li>Toluen</li><li>Benzen</li><li>t-butyl methyl ether</li><li>Chloroform</li><li>Dichlormethan</li><li>Diethylether</li><li>Ethylacetát</li><li>Tetrahydrofuran (THF)</li><li>Aceton</li><li>Acetonitril</li><li>40 % MeOH v acetonitrilu</li><li>20 % MeOH v diethyletheru</li><li>20 % MeOH v dichlormethanu</li><li>Isopropanol</li><li>Methanol</li><li>Voda</li><li>Kyselina octová</li></ul>

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

V tomto technickém tipu vám přinášíme několik užitečných doporučení pro práci s plynovou chromatografií (GC), konkrétně se zaměřením na instalaci kolon – od kondicionování, přes testování instalace až po kontrolu těsnosti. Správná instalace kolony a její bezchybný provoz jsou klíčové pro přesnou a spolehlivou analýzu. Podívejme se na hlavní osvědčené postupy:<h3>Kondicionování kolony</h3><ul><li>Před zahájením analýz nechte dostatečně dlouho protékat nosný plyn kolonou, aby došlo k odstranění kyslíku ze systému.</li><li>Poté zvyšte teplotu kolony na maximální izotermickou provozní teplotu uvedenou ve zkušebním protokolu ke konkrétní GC koloně. Tuto teplotu udržujte, dokud se nezíská stabilní základní linie. Doba kondicionování závisí na chemické povaze stacionární fáze a její tloušťce – silnější filmy se stabilizují déle. Pro minimalizaci prostojů lze kolony kondicionovat přes noc při této maximální izotermické teplotě.</li></ul><h3>Testování instalace</h3><ul><li>Pro ověření správné instalace vstříkněte nezadržovaný analyt, například methan (při detekci FID), a změřte dobu mrtvého objemu a lineární rychlost plynu při požadované teplotě. Tlak nosného plynu upravte dle požadovaného průtoku a zvoleného typu plynu.</li><li>Nezadržovaný pík musí mít ideální (symetrický) tvar. Pokud tomu tak není, je instalace vadná a je třeba ji zopakovat.</li></ul><h3>Kontrola těsnosti</h3><ul><li>Pro detekci netěsností použijte teploměr s termočlánkem – je vysoce citlivý na vodík, helium i dusík a zároveň nezpůsobuje kontaminaci systému. Kapalné indikátory úniku nejsou pro kapilární kolony vhodné – hrozí riziko nasátí kapaliny do kolony nebo armatur, což může vést ke kontaminaci.</li><li>Únik nosného plynu způsobí změnu vodivosti v okolí termočlánku, což se projeví jako kolísání naměřené teploty – to signalizuje možnou netěsnost. Tato metoda je bezkontaktní a minimalizuje riziko kontaminace kolony.</li></ul>Poznámka: Pokud používáte ferule z materiálu Vespel®, může po zahřátí dojít k jejich deformaci a následnému úniku. Po zahřátí je proto nutné armatury znovu dotáhnout a pečlivě zkontrolovat případné netěsnosti.Dodržování těchto doporučení pomáhá zajistit optimální výkon kolon, prodloužit jejich životnost a minimalizovat prostoje způsobené údržbou systému.

Plynová chromatografie (GC) – kondicionování, testování a kontrola kolon

Při hodnocení dat z HPLC analýzy se pozornost obvykle soustředí na retenční čas, asymetrii píku a účinnost. Tyto parametry umožňují identifikaci a kvantifikaci analytů – čím přesnější jsou tyto informace, tím vyšší je spolehlivost identifikace píku a koncentrace analytu.Kapacitní faktor bývá často opomíjeným parametrem separací, avšak při správném využití může výrazně přispět k vývoji robustnější analytické metody. Kapacitní faktor normalizuje retenční čas analytu vzhledem k rozměrům chromatografické kolony a je definován vztahem:<h5 style="text-align:center;">K' = (tᵣ − t₀) / t₀</h5>kde tᵣ je retenční čas analytu a t₀ je retenční čas nezadržované sloučeniny.Význam kapacitního faktoru lze nejlépe demonstrovat na příkladu:<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Kyselina šťavelová, 2. Kyselina vinná, 3. Kyselina glykolová, 4. Kyselina mravenčí, 5. Kyselina pyrohroznová, 6. Kyselina malonová, 7. Kyselina octová, 8. Kyselina maleinová, 9. Kyselina citronová." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_2_f6553ef593.jpg 245w," sizes="100vw" width="547" height="345">Zde máme separaci organických kyselin provedenou na koloně C18, která je stabilní až do 100% vodného prostředí. Mobilní fází je 20 mM fosfátový pufr o pH 2,9 s průtokem 0,7 ml/min. Na první pohled se zdá, že retence kyseliny šťavelové je téměř 4 minuty, ale při bližším pohledu je t₀ pro tuto kolonu přibližně 3,7 minuty. Pokud toto zohledníme, je zřejmé, že kyselina šťavelová – velmi polární dikyselina – nevykazuje prakticky žádnou retenci.<h5 style="text-align:center;">K' = (3,9 – 3,7) / 3,7 = 0,054</h5>To znamená, že kyselina šťavelová tráví během průchodu kolonou jen minimální čas ve stacionární fázi. V takových případech je retence analytu výrazně ovlivněna i drobnými, neúmyslnými změnami parametrů, jako jsou:<ul><li>složení mobilní fáze</li><li>pH mobilní fáze</li><li>síla rozpouštědla vzorku</li><li>teplota</li></ul>Taková metoda pravděpodobně nebude robustní, protože retence kyseliny šťavelové se bude lišit od jednoho běhu ke druhému, mezi různými kolonami nebo mezi šaržemi mobilní fáze.Z toho vyplývá doporučení, aby se při vývoji metod udržovaly kapacitní faktory v rozmezí 2–10. Viděli jsme potenciální problémy s kapacitními faktory menšími než 2, ale proč se zastavit právě na horní hranici 10?Při izokratické eluci se šířka píku zvyšuje s rostoucí retenční dobou vlivem difúze. Použití kolon s menšími částicemi a optimalizace průtoku může tento efekt částečně zmírnit, ale nelze jej zcela eliminovat. Navíc vysoké kapacitní faktory vedou k dlouhým retenčním časům, což je v rutinním laboratorním provozu obecně nežádoucí.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg" alt="Phenomenex: Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody? 1. Hydrokortizon, 2. Kortikosteron, 3. 11-a-hydroxytestosteron, 4. Kortizon acetát, 5. 11-ketoprogesteron." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_can_capacity_factors_drive_method_robustness_22b7c55c44.jpg 245w," sizes="100vw" width="685" height="339">Zde máme příklad analýzy steroidů na koloně o rozměrech 150 × 4,6 mm při průtoku 1 ml/min. 11-etoprogesteron eluoval přibližně po 17,5 minutách s kapacitním faktorem přibližně 10,6. Za těchto podmínek izokratické eluce je patrné, že došlo k rozšíření píků, což naznačuje, že poslední eluující analyty jsou na koloně zadržovány příliš dlouho.Porozumění obecnému doporučení (kapacitní faktory mezi 2 a 10) je užitečné, ale zůstává otázkou, jak kapacitní faktor účinně upravit?Kapacitní faktor je nepřímo úměrný eluční síle mobilní fáze – vyšší eluční síla snižuje kapacitní faktor a naopak. Pokud nelze nízký kapacitní faktor zvýšit snížením eluční síly mobilní fáze, může být vhodné přejít na stacionární fázi, která nabízí vyšší retenci analytů, například zvolit polárnější stacionární fázi pro separaci polárních analytů.

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Při stanovení potřebného množství sorbentu pro extrakci na pevné fázi (SPE) je nezbytné zohlednit matrici vzorku (např. sérum, plazma, moč, sliny, potraviny, říční voda, půda atd.). Na základě těchto informací a s využitím vhodné přehledové tabulky lze určit optimální hmotnost SPE sorbentu. Tyto tabulky odrážejí relativní obsah rušivých endogenních složek přítomných ve vzorcích.SPE zařízení musí mít dostatečnou kapacitu pro zachycení všech cílových analytů, stejně jako dalších látek z matrice, které se mohou na sorbent vázat obdobným typem interakce. Pokud je množství sorbentu nedostatečné, může při aplikaci vzorku dojít k průchodu části analytu sorbentem bez navázání, což vede ke snížené výtěžnosti a nižší reprodukovatelnosti mezi jednotlivými analýzami.<h3>Objem vzorku</h3><h4>Určuje hmotnost sorbentu/objem rozpouštědla</h4><img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_How_much_sample_can_I_load_onto_my_SPE_device_Is_it_linked_to_the_concentration_of_my_analyte_of_interest_12a9ab171c.jpg" alt="Phenomenex: Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE zařízení? Závisí to na koncentraci analytu?" srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_How_much_sample_can_I_load_onto_my_SPE_device_Is_it_linked_to_the_concentration_of_my_analyte_of_interest_12a9ab171c.jpg 154w," sizes="100vw" width="983" height="992"><h3>Obecné zatížitelnosti sorbentů:</h3><h4>Polymerní sorbenty: 10–15 % celkové hmotnosti sorbentu &nbsp;|&nbsp; Silikátové sorbenty: 5 % celkové hmotnosti sorbentu</h4>Například při použití 60 mg polymerního sorbentu (např.<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50&amp;search=Strata"> Strata™-X</a>) lze aplikovat přibližně 500 µl plazmy. Na tentýž sorbent lze ovšem zavést až 2 ml moči, což dokládá, že moč obsahuje výrazně méně rušivých složek než plazma.U typů vzorků, které nejsou zahrnuty v doporučených tabulkách, se doporučuje vycházet z uvedených obecných pravidel – 5 % hmotnosti sorbentu pro silikátové materiály, resp. 10–15 % pro polymerní sorbenty. Rozdíl mezi kapacitou silikátových a polymerních sorbentů je dán jednak vyšším specifickým povrchem polymerních materiálů, jednak vyšší hustotou ligandů – celý povrch polymeru slouží jako stacionární fáze, zatímco u silikátového materiálu se na extrakčním mechanismu reverzní fáze nebo iontové výměny podílí navázaná fáze.

Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE? Závisí to na koncentraci analytu?

<h4>1) Polarita</h4>Některé údaje o polaritě obvykle uvádí výrobce GC kolony, přičemž hodnota se obvykle stanoví pomocí Kovatsových retenčních indexů a McReynoldsových čísel. Obecně se doporučuje, aby polarita stacionární fáze co nejvíce odpovídala polaritě analyzovaných látek, takže pro analýzu uhlovodíků je vhodná <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://gcms.cz/products?category=355&amp;instrumentationItems=19&amp;manufacturerItems=50">nepolární fáze</a>, jako je ZB-1 (hodnocená jako 5 na stupnici polarity), zatímco pro alkoholy se často volí <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://gcms.cz/products?category=7&amp;instrumentationItems=19&amp;manufacturerItems=50&amp;search=wax">ZB-Wax</a> (57 na stupnici polarity).<h4>2) Selektivita</h4>Selektivita je určena různými funkčními skupinami přítomnými v polymerní stacionární fázi, jejíž základ tvoří polysiloxan nebo polyethylenglykol. Polysiloxanové fáze mají obvykle k polysiloxanovým řetězcům připojené methylové, fenylové nebo kyanopropylové skupiny, které umožňují různé interakce:<ul><li>Methylové skupiny: van der Waalsovy síly nebo Londonovy síly,</li><li>Fenylové skupiny: π-π interakce,</li><li>Kyanové skupiny: π-π a dipól-dipól interakce.</li></ul>Zvýšení procenta fenylových nebo kyanopropylových skupin ve stacionární fázi zvyšuje polaritu. Fáze polyethylenglykolu (PEG) nabízejí místa pro dipól-dipólové a vodíkové vazby. Fáze PEG patří obvykle k nejpolárnějším dostupným fázím.<h4>3) Délka</h4>Se zvyšující se délkou kolony se zvyšuje počet teoretických pater, což napomáhá rozlišení, avšak se zvyšující se délkou kolony se také prodlužuje doba jakékoli prováděné analýzy. Kolona o délce 30 m je obecně dobrým výchozím bodem pro vývoj obecné metody, zatímco kolony o délce 60 m se obvykle používají pro analýzu komplexních směsí. Kolony o délce 15 m se obecně používají, když je vyžadováno rychlé oddělení méně komplexních směsí.<h4>4) ID</h4>Volba ID kolony má vliv jak na kapacitu kolony (kolik analyzované látky můžete nastříknout), tak na účinnost. Čím užší je vnitřní průměr kolony, tím vyšší je účinnost, ale nižší je její kapacita. Dobrým výchozím bodem pro vývoj metody je kolona s vnitřním průměrem 0,25 mm, která představuje dobrý kompromis mezi účinností a kapacitou. Pokud převádíte metodu ze staršího typu GC kolony s náplní na kapilární GC kolony, často se volí kolony s vnitřním průměrem 0,53 mm kvůli jejich vyšší kapacitě.<h4>5) Tloušťka filmu</h4>Tenké filmy poskytují nejvyšší účinnost, ale mají nižší retenci analyzované látky. Silnější filmy mají vyšší kapacitu, ale při vysokých teplotách dochází k většímu krvácení. Pokud se rozhodnete použít tenký film (0,1–0,25 µm) s aktivními analyzovanými látkami, je lepší zvolit kolonu, která je vysoce deaktivovaná, aby se zabránilo rozšiřování píků. Takové kolony obecně poskytují také menší prosakování.

Jaké parametry bych měl(a) zvážit při výběru GC kolony pro svou aplikaci?

Silikagel používaný k plnění HPLC kolon je polymerem křemíku a kyslíku s povrchovými skupinami Si–OH (silanoly). Na tyto silanolové skupiny se navazují funkční skupiny pomocí silanizačního činidla za účelem funkcionalizace základního nosiče.Při funkcionalizaci HPLC kolon není možné dosáhnout 100% pokrytí fáze ani navázat všechny dostupné silanolové skupiny (volné hydroxylové skupiny na povrchu silikagelu) na stacionární fázi. Vlivem sterických překážek se s postupujícím navazováním fáze zvyšuje prostorové omezení, takže další reakce jsou obtížnější než ty předchozí.Bez end-cappingu by na koloně zůstalo značné množství přístupných, vysoce reaktivních zbytkových silanolových skupin, které mohou ovlivnit selektivitu stacionární fáze. Tyto zbytkové skupiny mohou vytvářet silné iontové a polární interakce (často označované jako „sekundární interakce“) s polárními a bazickými skupinami v analyzovaných sloučeninách. Proto je snížení počtu volných silanolů po navázání stacionární fáze pomocí end-cappingu nezbytné.Historicky se k end-cappingu používaly malé hydrofobní skupiny, povahou podobné trimethylsilanu. V posledních letech někteří výrobci zavedli další typy skupin, které dodávají koloně <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=6998&amp;elqTrackId=D5A4A87A868E75FA6693FC5A1E9B3C89&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=5674&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5A07C3CDAC28222BF387672C6F595E7A5CF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*175w36l*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*czE3NTAwMTE2NzAkbzI1JGcwJHQxNzUwMDExNjcwJGo2MCRsMCRoMA..">nový selektivní prvek</a>.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_a458911946.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_a458911946.jpg 245w," sizes="100vw" width="767" height="214">Pokud end-cappingové činidlo obsahuje nabité funkční skupiny, propůjčuje povrchu iontoměničovou funkci a dává koloně iontoměničové vlastnosti spolu s <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://app.explore.phenomenex.com/e/er?s=822460770&amp;lid=8525&amp;elqTrackId=63166B02CED6893A95911CAE6AA3AE95&amp;elq=00000000000000000000000000000000&amp;elqaid=5674&amp;elqat=2&amp;elqak=8AF5B477F9C56C31BC7CAC9FBFB946361A9ECF7C906A90E1BF5C55FDC1EA7D8B80B0&amp;_gl=1*1vag7yn*_ga*MTM5ODI2NzM3NS4xNzQyMjc3MDM0*_ga_790WGKEF4G*czE3NTAwMTE2NzAkbzI1JGcwJHQxNzUwMDExNjcwJGo2MCRsMCRoMA..">reverzně-fázovými interakcemi</a> vycházejícími z C18 ligandů. Podobně polární skupiny dodávají povrchu polární charakter.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_4_e1b1855040.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_4_e1b1855040.jpg 245w," sizes="100vw" width="786" height="246">Nyní, když jsme si vysvětlili roli end-cappingu, shrňme si hlavní přínosy funkcionalizace silikagelu v závislosti na použitých chemických skupinách.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_3_be82757ab7.jpg" alt="Phenomenex: Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_The_Role_of_End_Capping_in_RP_3_be82757ab7.jpg 137w," sizes="100vw" width="640" height="728">Stručně řečeno, nové technologie end-cappingu mohou významně zlepšit analýzu sloučenin, které dříve představovaly chromatografickou výzvu. Například dnes lze dosáhnout vynikajícího tvaru píků a kratších retenčních časů při analýze bazických léčiv pomocí <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=PS">kolon PS-C18</a>. Fáze <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=polar">Polar C18</a> se osvědčila pro retenci metabolitů a fáze <a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=341&amp;manufacturerItems=50&amp;search=XB">XB-C18 </a>poskytuje výbornou chromatografii peptidů, s výrazně vyšší retencí malých polárních peptidů.

Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)

<a target="_blank" rel="noopener noreferrer" href="https://lcms.cz/products?category=136&amp;manufacturerItems=50">Extrakce na pevné fázi</a> (SPE) je běžně volenou metodou přípravy vzorků před analýzou pomocí HPLC a GC. Poskytuje:<ul><li>Čištění vzorku;</li><li>Předkoncentraci analyzované látky;</li><li>Výměnu rozpouštědla.</li></ul>Tato metoda dobře funguje pro homogenní kapalné vzorky, avšak je zřejmé, že pevný vzorek nelze přímo aplikovat na SPE zařízení. V tomto textu se zaměříme na to, jak nejlépe přistupovat k přípravě pevných vzorků před SPE.První fáze předúpravy vzorku zahrnuje homogenizaci pevného vzorku s vhodným rozpouštědlem. Vybrané rozpouštědlo by mělo:<ul><li>Účinně rozpouštět analyt;</li><li>Účinně rozpouštět matrici vzorku (i když to není nezbytné, pokud je vzorek dobře promíchán s rozpouštědlem);</li><li>Ideálně být slabým rozpouštědlem z pohledu následující SPE fáze. To však nemusí být vždy možné, a proto může být nutné vzorek vysušit a následně rekonstituovat před aplikací na SPE kolonu.</li></ul>Po vytvoření suspenze vzorku ve vhodném rozpouštědle by měl být vzorek promíchán na vortexu pro důkladné promísení a následně centrifugován, aby se usadily nerozpustné složky matrice. Supernatant (kapalná fáze) se poté oddělí a dále zpracovává.V tomto okamžiku je nutné zvolit odpovídající SPE mechanismus:<h3>Metoda reverzní fáze SPE</h3><h4>Mechanismus / slabé rozpouštědlo / silné rozpouštědlo</h4><ul><li>Reverzní fáze – voda/pufr – acetonitril/methanol (nejsilnější je hexan)</li><li>Normální fáze – hexan/heptan – středně polární organická rozpouštědla, jako je DCM, MTBE, IPA (nejsilnější je voda)</li><li>Iontová výměna – vodný pufr s pH, které podporuje iontové výměnné interakce mezi analyzovanou látkou a sorbentem SPE – organické rozpouštědlo, obvykle methanol s úpravou pH pro narušení iontových výměnných interakcí.</li></ul>V tomto bodě je třeba vzít v úvahu jak vlastnosti analytu, tak i rozpouštědlo použité pro přípravu vzorku. Extrakce na reverzní fázi je účinná pro středně polární až středně hydrofobní analyty, ale pouze pokud jsou rozpuštěny ve slabém rozpouštědle, např. ve vodě. Pokud je vzorek rozpuštěn ve středně polárním rozpouštědle, je třeba jej buď zředit, nebo vysušit a rekonstituovat. Totéž platí pro normální fázi, kdy musí být vzorky rozpuštěny v hexanu nebo heptanu, aby bylo dosaženo účinné retence analytu během nanášení vzorku na SPE zařízení.Následující příklady mají tento princip ilustrovat:<h4>Extrakce PCB z půdy</h4>PCB jsou hydrofobní a dobře se rozpouštějí v nepolárních rozpouštědlech. Zeminu lze vysušit, zvážit a extrahovat pomocí hexanu nebo heptanu. Po důkladném promíchání a centrifugaci lze získaný roztok aplikovat přímo na kondicionovanou SPE kolonku se silikagelem, čímž se provede extrakce na &nbsp;normální fázi.<h4>Tylosin z masa</h4>Tylosin je antibiotikum s hodnotou log P = 1,0. Extrakcí masa směsí acetonitrilu a vody (80:20) dojde k narušení hydrofobních interakcí a uvolnění tylosinu. Po centrifugaci bude nutné další naředění vodou, aby se snížila síla rozpouštědla před extrakcí na reverní fázi.<h4>Enilkonazol z pomerančů</h4>Enilkonazol je fungicid běžně používaný v zemědělství, zejména u citrusových plodů. Lze jej snadno extrahovat z pomerančů pomocí acetonitrilu. Jelikož je enilkonazol zásaditý, přidání HCl do acetonitrilového extraktu podpoří protonaci analytu, což umožní jeho přímou retenci na SPE sorbentu se silnými katexovými vlastnostmi (SCX). Tento postup výrazně zjednodušuje extrakci, protože není potřeba žádné ředění vzorku (na rozdíl od extrakce na reverzní nebonormální fázi, kde by 100% acetonitril způsobil, že by se analyt během nanášení nezachytil).

Na co myslet při práci s pevnými vzorky a SPE

Technický tip tohoto měsíce se zaměřuje na klíčové téma: Jak zvolit správné rozměry GC kolony? Při zahájení nového projektu nebo při vylepšování stávající metody je důležité vyhodnotit, jaký vliv mají jednotlivé parametry kolony (délka, vnitřní průměr (ID) a tloušťka filmu) na rozlišení, citlivost a robustnost metody.Dalším faktorem, který je třeba při investici do GC kolon zvážit, je výběr spolehlivého výrobce. Výrobci provádějí řadu testů svých kolon, než se dostanou k zákazníkům. Tyto testy zahrnují rozlišení kritických párů, test krvácení kolony, retenční faktor zkušebních analytů, účinnost kolony a další. Ujistěte se, že volíte výrobce, který poskytuje kolony s individuálním testováním kvality (QC).Pro maximalizaci účinnosti v GC mají délka kolony, vnitřní průměr (ID) a tloušťka filmu zásadní vliv. Znalost vlivu rozměrů kolony na separaci v GC pomáhá nejen při výběru vhodných rozměrů, ale i při volbě alternativních parametrů pro dosažení účinné chromatografické separace a případně zkrácení doby analýzy.Podívejme se nyní podrobněji, jak tyto parametry ovlivňují separaci:<h4>Délka kolony</h4>Délka kolony ovlivňuje míru zlepšení rozlišení. S rostoucí délkou se zvyšuje i rozlišení, ale zároveň narůstá doba analýzy. Za izotermních podmínek zdvojnásobení délky kolony zlepší rozlišení jen o 41 %, ale zdvojnásobí dobu běhu. Zvolte délku kolony, která vyvažuje účinnost a přijatelnou dobu analýzy.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_GC_Column_Selection_by_Column_Dimension_1_8c584730ec.jpg" alt="Phenomenex: Výběr GC kolony podle jejích rozměrů: Délka kolony." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_GC_Column_Selection_by_Column_Dimension_1_8c584730ec.jpg 245w," sizes="100vw" width="1702" height="598"><h4>Vnitřní průměr (ID)</h4>Vnitřní průměr kolony má výrazný vliv na rozlišení i kapacitu vzorku. Na rozdíl od délky může použití kolon s menším ID vést ke kratší době běhu, protože díky vyšší účinnosti často postačuje kratší délka kolony.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_GC_Column_Selection_by_Column_Dimension_2_c95f77d2fa.jpg" alt="Phenomenex: Výběr GC kolony podle jejích rozměrů: Vnitřní průměr." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_GC_Column_Selection_by_Column_Dimension_2_c95f77d2fa.jpg 245w," sizes="100vw" width="1740" height="583"><h4>Tloušťka filmu</h4>Tloušťka filmu ovlivňuje retenci analytu a hraje důležitou roli v kapacitě kolony. Kolony s tenkým filmem poskytují vyšší rozlišení a rychlejší separaci, ale mají nižší kapacitu. Ve většině případů je vhodné zvolit co nejtenčí film, který zajistí potřebnou retenci. Při práci s aktivními vzorky může mírně silnější film výrazně zlepšit tvar píku.<img src="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/Phenomenex_GC_Column_Selection_by_Column_Dimension_3_8fb68c44cb.jpg" alt="Phenomenex: Výběr GC kolony podle jejích rozměrů: tloušťka filmu." srcset="https://storage.googleapis.com/labrulez-bucket-strapi-h3hsga3/thumbnail_Phenomenex_GC_Column_Selection_by_Column_Dimension_3_8fb68c44cb.jpg 245w," sizes="100vw" width="1740" height="583">

 Výběr GC kolony podle jejích rozměrů

Webináře

Aplikace

Akademie

Osobnosti

Plasty

Životní prostředí

Potraviny

Vody

Zdraví

Přednáška

Vědecký článek

Rozhovor

Toxikologie

Popularizace

Věda a výzkum

Software

Covid-19

Kariéra

Článek

Laboratoře

Různé

PFAS

Produkt

Video

Poster

Nejbližší akce

Typ novinky

Zaměření

Společnost Phenomenex je celosvětovým technologickým lídrem, který se zabývá vývojem nových řešení v oblasti analytické chemie, jež řeší požadavky analytiků na separace a purifikace v průmyslových, vládních a akademických laboratořích.

Výběr GC kolony podle jejích rozměrů

Na co myslet při práci s pevnými vzorky a SPE

Úloha end-cappingu v reverzní fázi (RP)

Jaké parametry bych měl(a) zvážit při výběru GC kolony pro svou aplikaci?

Jaké množství vzorku lze aplikovat na SPE? Závisí to na koncentraci analytu?

Jak mohou kapacitní faktory ovlivnit robustnost metody?

Plynová chromatografie (GC) – kondicionování, testování a kontrola kolon

Jak se liší SPE na normální fázi (NP) od SPE na reverzní fázi (RP)? Jak se rozhodnout, kterou zvolit?

Vliv gradientu na pufrační kapacitu

Instalace kolony pro plynovou chromatografii (GC) – instalace do detektoru

Nejbližší akce

27. Škola hmotnostní spektrometrie 2026

Validace analytické metody a použití programu Excel - 2026

Altium Podzimní semináře na Moravě 2026

Webináře

How to Perform Routine Quantification by FTIR: Tips & Tricks Workshop

Learn How FTIR Can Help You with Contamination and Poor Product Quality

Expanding the Evidence: New Data for More Reliable PFAS Analysis