Manuální a automatizované hybridní vyhledávání v NIST26

Za hranicí přesných shod: manuální a automatizované hybridní vyhledávání v NIST26

Konvenční vyhledávání v knihovnách MS/MS spekter funguje nejlépe tehdy, když spektrum neznámé sloučeniny dobře odpovídá referenčnímu spektru, které je již v knihovně uloženo. Reálné vzorky však často obsahují látky, které v dostupných knihovnách chybějí. James Little ze společnosti Mass Spec Interpretation Services ve své prezentaci Manual and Automated Hybrid Searches in NIST26 ukazuje, jak mohou možnosti hybridního vyhledávání v NIST26 rozšířit prakticky využitelné pokrytí knihovny. Umožňují vyhledávat strukturně příbuzné sloučeniny a využít vztahy mezi jejich spektry jako vodítko při identifikaci neznámých látek.

Rozšíření vyhledávání v knihovnách MS/MS za hranici přesných shod

Konvenční vyhledávání v knihovně se snaží nalézt spektra, která se co nejvíce podobají naměřenému spektru. Pokud je k dispozici odpovídající referenční spektrum, může tento přístup poskytnout velmi spolehlivou identifikaci. Jeho možnosti se však výrazně omezují v případě, kdy samotná neznámá sloučenina v knihovně chybí.

Funkce Hybrid MS/MS Search v programu NIST Mass Spectral Search Program využívá jiný přístup. Nevyžaduje přesnou spektrální shodu, ale dokáže rozpoznat spektra strukturně příbuzných sloučenin a zohlednit systematické rozdíly v hmotnosti mezi neznámou látkou a kandidáty z knihovny. Díky tomu lze existující referenční spektra využít i při zkoumání sloučenin, které dosud nebyly samy změřeny a zařazeny do knihovny.

V NIST26 lze hybridní vyhledávání provádět dvěma způsoby:

• manuálně odesláním jednotlivých spekter do okna Library Search,
• automaticky v rámci pracovního postupu Chromatogram.

Oba přístupy se vzájemně doplňují. Automatizované vyhledávání umožňuje rychle prověřit velké množství chromatografických komponent, zatímco manuální vyhledávání dává analytikovi více prostoru pro detailní posouzení jednotlivých kandidátů a jejich struktur.

Využití hmotnostních rozdílů k rozpoznání strukturních vztahů

Důležitou součástí hybridního vyhledávání je interpretace hmotnostního rozdílu mezi spektrem neznámé látky a spektrem příbuzné sloučeniny z knihovny.

NIST26 tento rozdíl uvádí společně s parametrem Δform (dForm), který představuje možný elementární vzorec odpovídající pozorovanému posunu hmotnosti. Namísto toho, aby byl odlišný prekurzorový ion považován za důkaz, že spolu dvě sloučeniny nesouvisejí, může software posoudit, zda daný rozdíl odpovídá chemicky smysluplné strukturní modifikaci.

Prezentace rovněž upozorňuje na parametr pctRefForm, statistický ukazatel související s tím, jak často se daný dForm vyskytuje ve srovnání s běžně pozorovanými strukturními změnami. Vyšší hodnoty odpovídají častějším, a tedy obecně pravděpodobnějším rozdílům ve vzorci. Naopak velmi vzácné rozdíly mohou být náhodné a je třeba je interpretovat opatrně.

Tyto doplňující informace posouvají výsledek knihovního vyhledávání od pouhé spektrální podobnosti směrem k výchozímu bodu pro strukturní interpretaci.

Manuální postup pro zkoumání neznámých chromatografických komponent

James Little představuje praktický postup, při kterém je nejprve provedeno standardní vyhledávání chromatogramu a následně jsou k dalšímu zkoumání vybrány komponenty, u nichž nebylo dosaženo spolehlivé identifikace.

Neidentifikované komponenty lze seřadit podle relativní intenzity, takže se analytik může nejprve zaměřit na nejvýznamnější signály. Jednotlivá spektra je následně možné procházet, porovnávat například pomocí tzv. butterfly plots, a zajímavé komponenty ručně odeslat do okna Library Search pro hybridní vyhledávání.

Tento postup je užitečný zejména tehdy, když standardní automatizované vyhledávání neposkytne uspokojivou identifikaci, ale spektrum stále obsahuje dostatek strukturních informací k tomu, aby bylo možné určit příbuznou skupinu sloučenin.

Identifikace neznámé látky související s PEG

Prezentace celý postup demonstruje na neznámé látce související s materiály na bázi polyethylenglykolu (PEG). Ve spektru byl pozorován amonný adukt (M+NH₄)⁺ následovaný ztrátou amoniaku.

Hybridní vyhledávání poskytlo kandidáty odpovídající PEG etherům, přičemž jako nejpravděpodobnější interpretace byl vyhodnocen dodecylether polyethylenglykolu. Navržený knihovní kandidát byl následně analyzován pomocí nástroje NIST MS Interpreter s cílem lépe porozumět jeho fragmentačnímu chování.

Zvláště důležitou informaci poskytl pozorovaný hmotnostní rozdíl. Parametr dForm ukázal na ztrátu odpovídající třem opakujícím se jednotkám ethylenglykolu, přičemž pozorovaná hodnota 132,079 přesně odpovídala teoretické hodnotě 132,079. Tato shoda dále podpořila předpoklad, že neznámá látka a kandidát z knihovny patří do stejné strukturní skupiny, liší se však délkou PEG řetězce.

Strukturu kandidáta bylo následně možné upravit odstraněním tří opakujících se jednotek ethylenglykolu a znovu ji odeslat do nástroje MS Interpreter k dalšímu posouzení. Tento příklad dobře ukazuje, že hybridní vyhledávání umožňuje posunout se od jednoduché otázky „Která sloučenina se nachází v knihovně?“ k mnohem užitečnější otázce „Jak se může moje neznámá látka lišit od nejbližší známé struktury?“

Proč vyžadují amonné adukty zvláštní pozornost

Chemie aduktů může vyhledávání v knihovnách MS/MS komplikovat. V uvedeném příkladu byl experimentální prekurzor pozorován jako (M+NH₄)⁺, zatímco knihovna NIST MS/MS obsahuje více spekter získaných z prekurzorů (M+H)⁺.

Prezentace upozorňuje, že při získávání referenčních spekter NIST není amonium záměrně přidáváno. Pokud tedy analytik pozoruje ztrátu 17 Da, odpovídající NH₃, může být užitečné vzít v úvahu, že následná fragmentace ve skutečnosti odpovídá protonované molekule.

V takových případech Little doporučuje nahradit při vyhledávání hodnotu prekurzoru odpovídající hodnotou (M+H)⁺, namísto použití pouze prekurzoru zobrazeného v experimentálním spektru.

V případě PEG vedl tento postup stále ke dvěma kandidátům z oblasti monodecylových etherů jako k nejlepším shodám. Důležité je, že podle prezentace byly hlavní fragmenty MS/MS vznikající z amonného i protonovaného prekurzoru v zásadě stejné. To podporuje možnost porovnání s referenčními spektry protonovaných molekul.

Automatizace hybridního vyhledávání v celém chromatogramu

Manuální posouzení je velmi užitečné při analýze menšího počtu významných neznámých sloučenin, chromatografická data však mohou obsahovat stovky komponent. NIST26 proto umožňuje provádět hybridní vyhledávání také automatizovaně přímo v rámci pracovního postupu Chromatogram.

Analytik vybere vstupní soubor, aktivuje možnost Hybrid Search a může zvolit spuštění analýzy na pozadí. Protože hybridní vyhledávání provádí výrazně více výpočetních operací než standardní postup, může podle prezentace trvat podstatně déle. NIST26 zobrazuje stav úlohy běžící na pozadí a po dokončení zpracování uživatele upozorní.

Výsledné komponenty lze následně filtrovat tak, aby se analytik zaměřil například pouze na neidentifikované látky, a seřadit je podle jejich intenzity. V prezentovaném příkladu automatizované vyhledávání poskytlo stejného kandidáta souvisejícího s PEG jako předchozí manuální analýza, což ukazuje dobrou shodu mezi oběma přístupy.

Automatizované hybridní vyhledávání tak může sloužit jako efektivní nástroj pro prvotní screening. Vybrané výsledky lze následně přesunout do okna Library Search a detailněji posoudit struktury kandidátů i jejich fragmentační chování.

Od shody v knihovně k interpretaci struktury

Hybridní vyhledávání nenahrazuje odbornou interpretaci výsledků. Rozšiřuje však množství informací, které má analytik k dispozici v situaci, kdy přesné referenční spektrum neznámé látky v knihovně chybí.

Kombinací spektrální podobnosti, rozdílů v hmotnosti prekurzorů, pravděpodobných hodnot dForm, interpretace fragmentace a úprav navržených struktur poskytuje NIST26 workflow, které umožňuje postupovat od neidentifikovaného chromatografického signálu směrem k chemicky smysluplnému kandidátovi.

Prezentace ukazuje, že nejefektivnějším přístupem je často kombinace automatizace a manuální interpretace. Automatizované vyhledávání umožňuje odhalit slibné vztahy napříč rozsáhlými datovými soubory, zatímco cílená manuální analýza pomáhá ověřit, zda jsou tyto vztahy chemicky smysluplné. Hybridní vyhledávání tak rozšiřuje praktickou hodnotu spektrálních knihoven i za hranici sloučenin, které jsou v nich přímo zastoupeny, a umožňuje jejich efektivnější využití při studiu dosud necharakterizovaných analytů.