Více možností identifikace s NIST Library Search

Vyhledávání v knihovně přímo z chromatogramu může poskytnout rychlou prvotní identifikaci, ne vždy však nabízí dostatečnou flexibilitu pro posouzení alternativních sloučenin, úpravu nastavení prekurzoru nebo volbu různých strategií porovnávání spekter. James Little ze společnosti Mass Spec Interpretation Services ve své prezentaci ukazuje, jak může přenos výsledků chromatogramu do standardního okna NIST Library Search rozšířit možnosti vyhledávání a nabídnout podrobnější pohled na potenciální shody sloučenin.

Tento postup je zvláště užitečný v případech, kdy analytik nechce zůstat pouze u nejlepšího výsledku z chromatogramu, ale potřebuje prověřit další možné kandidáty z knihovny, porovnat spektra pomocí různých způsobů skórování nebo provádět MS/MS vyhledávání s větší kontrolou nad informacemi o prekurzoru.

Proč přejít z chromatogramu do Library Search?

Zobrazení chromatogramu je vhodné pro rychlou kontrolu výsledků, podle prezentace jsou však jeho možnosti knihovního vyhledávání omezenější.

Jedním z hlavních rozdílů je, že seznam výsledků v chromatogramu zobrazuje pouze nejlepší výsledek knihovního vyhledávání, zatímco standardní okno Library Search umožňuje zobrazit také alternativní kandidáty. To může být důležité například tehdy, když několik struktur poskytuje podobná spektra nebo když je potřeba nejlépe hodnocenou shodu dále ověřit.

Standardní okno Library Search nabízí také větší kontrolu nad MS/MS vyhledáváním. Zatímco při vyhledávání spuštěném přímo z chromatogramu se automaticky použijí informace o prekurzoru předané z chromatogramu, v Library Search lze pracovat s různými režimy vyhledávání a v případě potřeby nastavení prekurzoru upravit.

Přenos vybrané komponenty z chromatogramu do Library Search je podle prezentovaného postupu jednoduchý: klikněte pravým tlačítkem na požadovanou komponentu a zvolte „Library Search“.

Vyhledávání Identity a Similarity

Po přenosu spektra určuje způsob porovnání s knihovnou zvolené nastavení vyhledávání.

Při zvoleném režimu Identity lze MS/MS vyhledáváním zopakovat typ vyhledávání prováděný přímo z chromatogramu. Pokud je aktivována možnost „In spectrum“, automaticky se použije prekurzor předaný z chromatogramu. Tuto možnost lze také vypnout a zadat jiný prekurzor ručně.

Další možností je HiRes No Precursor. V tomto režimu jsou spektra porovnávána bez omezení vyhledávání podle prekurzorového iontu. Prezentace tento přístup uvádí jako užitečný pro získání informací o substruktuře, protože porovnání není omezeno pouze na knihovní záznamy odpovídající zadanému prekurzoru.

Režim Similarity zpřístupňuje Hybrid Search. Také zde lze automaticky použít prekurzor importovaný z chromatogramu nebo jej nahradit jinou hodnotou. Hybrid Similarity je v původní sérii prezentací probíráno samostatně, jeho dostupnost je však jedním z důvodů, proč využívat plnohodnotné prostředí Library Search.

Volba správné metody porovnání spekter

Okno Library Search nabízí několik způsobů hodnocení spektrální podobnosti:

• Full Spectrum Search
• Impurity Tolerant Search (Reverse-Dot)
• Partial Spectrum Search (PSS-Dot)

Každý z nich je určen pro jinou analytickou situaci.

• Full Spectrum Search porovnává kompletní experimentální a knihovní spektrum a je nejvhodnější tehdy, když je naměřené spektrum čisté a úplné.
• Reverse-Dot se zaměřuje především na to, zda jsou významné píky knihovního spektra přítomny také v experimentálním spektru. Dodatečné píky v naměřeném spektru, které v knihovním spektru nejsou, nejsou penalizovány stejným způsobem. Tento přístup tak může být tolerantnější vůči chemickému pozadí nebo spektrální kontaminaci.
• Partial Spectrum Search řeší opačnou situaci. Výrazně nepenalizuje knihovní píky, které v experimentálním spektru chybějí, a je proto vhodný pro neúplná spektra, například v případech, kdy je pozorována pouze část fragmentových iontů, jako u některých MS/MS nebo filtrovaných dat.

Přestože výsledková tabulka může zobrazovat více metrik podobnosti, metoda zvolená ještě před zahájením vyhledávání je důležitá kvůli způsobu, jakým funguje Presearch.

Proč je Presearch důležitý

NIST využívá krok Presearch ke snížení počtu knihovních spekter, která následně procházejí podrobnějším porovnáním.

Tím se vyhledávání výrazně zrychluje, zároveň to ale znamená, že spektra vyřazená během Presearch se již v konečných výsledcích neobjeví – i kdyby podle jiné metriky skórování mohla dosáhnout dobrého hodnocení.

Proto prezentace zdůrazňuje, že pokud je důležité chování Reverse-Dot nebo Partial Spectrum, je vhodné zvolit odpovídající metodu vyhledávání ještě před spuštěním Presearch.

Například provedení standardního Full Spectrum Search a následné seřazení výsledků podle Reverse-Dot nemusí vést ke stejnému souboru kandidátů, jaký by vznikl při použití Impurity Tolerant Search od samého začátku. Někteří potenciálně relevantní kandidáti totiž již mohli být během úvodního Presearch vyřazeni.

Pro běžné vyhodnocení prezentace doporučuje používat jako hlavní kritérium řazení celkové NIST Score a současně mít na paměti, že specializované typy vyhledávání mohou vyžadovat jinou strategii již od začátku.

Výběr knihoven a hmotnostních tolerancí

Před spuštěním vyhledávání mohou analytici určit, které knihovny mají být do vyhledávání zahrnuty.

Prezentace ukazuje nastavení Library Search, ve kterém lze jednotlivé spektrální knihovny přidávat nebo odebírat. Vyhledávání tak lze přizpůsobit konkrétní aplikaci namísto automatického prohledávání všech dostupných knihoven.

U vysoko­rozlišovacích MS/MS dat lze zároveň nastavit hmotnostní tolerance jak pro prekurzorové, tak pro produktové ionty.

Tato nastavení jsou důležitá, protože příliš široké tolerance mohou zvýšit počet nerelevantních kandidátů, zatímco zbytečně úzké tolerance mohou naopak vyloučit platné shody. Vhodné hodnoty by proto měly odpovídat kvalitě dat a hmotnostní přesnosti použitého měření.

Software nabízí také další možnosti související s prací s prekurzorem a se shodou polarity.

Jak interpretovat skóre výsledků

Po dokončení vyhledávání lze výsledkovou tabulku upravit tak, aby byla kontrola výsledků co nejefektivnější.

Jednotlivé vlastnosti lze přidávat, měnit jejich pořadí, upravovat šířku sloupců a používat je pro řazení. Podle prezentace je obvykle vhodné výsledky nejprve kontrolovat podle hodnoty Score.

Mezi dvě související metriky probírané v prezentaci patří dot product a NIST Score.

Dot product vyjadřuje přímou podobnost mezi dvěma spektry na základě společných píků a jejich intenzit. NIST Score na tomto porovnání dále staví pomocí dodatečného vážení a škálování. Podle prezentace to pomáhá zachovat užitečné výsledky porovnání i v případech, kdy jsou spektra neúplná, například u MS/MS nebo filtrovaných spektrálních dat.

Výsledky lze řadit také podle hodnot Rev-Dot nebo Partial Spectrum Search (PSS). Stále však platí omezení dané úvodním Presearch: pouhým seřazením výsledků nelze znovu získat kandidáty, kteří byli vyřazeni ještě před podrobným porovnáním.

V rozhraní výsledků lze navíc efektivně procházet jednotlivé záznamy pomocí šipek na klávesnici a zobrazované vlastnosti lze uspořádat podle preferovaného způsobu práce analytika.

Další filtry pro rychlejší vyhodnocení

Prezentace upozorňuje také na dva užitečné filtry aplikované po vyhledávání:

• Best Matching Only
• MS/MS Hit Filter List options

Na rozdíl od Presearch jsou tyto filtry aplikovány až po dokončení vyhledávání kandidátů. Lze je proto zapínat a vypínat, aniž by byly kandidátní výsledky z procesu vyhledávání trvale odstraněny.

• Možnost Best Matching Only odstraní velkou část duplicitních výsledků a může zpřehlednit seznam kandidátů.
• MS/MS Hit Filter nabízí další možnosti filtrování výsledků tandemové MS, včetně parametrů souvisejících s typem přístroje a povolenými formami prekurzorů.

James Little uvádí, že tyto filtry obvykle ponechává při první kontrole vypnuté a aktivuje je až podle potřeby. Tím zůstává při počátečním vyhodnocení zachován kompletní soubor výsledků a filtrování lze následně využít pro efektivnější práci s daty.

Větší flexibilita při identifikaci pomocí spektrálních knihoven

Hlavní výhodou přenosu výsledků chromatogramu do plnohodnotného okna NIST Library Search není to, že by původní vyhledávání z chromatogramu bylo nesprávné. Specializované vyhledávací prostředí však poskytuje analytikovi větší kontrolu nad způsobem, jakým je spektrum prohledáváno a porovnáváno.

Umožňuje kontrolovat alternativní kandidáty, měnit omezení týkající se prekurzoru, volit různé strategie Identity a Similarity a používat specializované porovnání celých spekter, impurity-tolerant vyhledávání nebo Partial Spectrum Search.

Workflow zároveň upozorňuje na důležitý princip knihovního vyhledávání: metoda skórování použitá při kontrole výsledků a metoda použitá pro vytvoření kandidátního souboru nejsou nutně zaměnitelné. Protože Presearch určuje, která knihovní spektra postoupí do detailního porovnání, je vhodné zvolit ještě před zahájením vyhledávání strategii, která nejlépe odpovídá charakteru experimentálního spektra.

Takto využívané okno NIST Library Search může nabídnout flexibilnější a transparentnější workflow pro zkoumání chromatografických komponent a hodnocení shod v MS/MS spektrálních knihovnách.