ProtiFi Tryp-N™ Sequencing Grade Kit je sada s termofilní metaloproteázou Tryp-N™ určenou pro enzymatické štěpení proteinů před LC-MS/MS analýzou. Tryp-N™ štěpí peptidové vazby na N-terminální straně lysinu (K) a argininu (R), tedy s opačnou orientací specificity než trypsin, a vytváří peptidy poskytující MS/MS spektra s převahou b-iontů. Díky tomu představuje komplementární alternativu k trypsinu zejména pro strukturní charakterizaci proteinů, lokalizaci posttranslačních modifikací, de novo sekvenování a MRM analýzu.
Tryp-N™ pracuje při zvýšených teplotách 55–65 °C, přičemž optimální teplota enzymu je přibližně 65 °C. Vyšší teplota podporuje denaturaci obtížně štěpitelných proteinů a současně deaktivuje řadu endogenních proteáz a fosfatáz. Digesci lze provést během minut až několika hodin místo běžného štěpení přes noc.
Princip štěpení Tryp-N™
Trypsin štěpí proteiny na C-terminální straně lysinu a argininu, zatímco Tryp-N™ štěpí na jejich N-terminální straně. Výsledné peptidy proto mají bazické centrum na N-konci společně s postranním řetězcem K nebo R.
Toto rozložení náboje podporuje při tandemové hmotnostní spektrometrii vznik spekter s převahou b-iontové série. Fragmentační spektra mohou být jednodušší a lépe interpretovatelná, což je výhodné například při:
- potvrzování sekvence peptidů,
- lokalizaci fosforylace a dalších PTM,
- de novo sekvenování,
- cílené MRM analýze,
- doplnění informací získaných po štěpení trypsinem.
Rychlá digesce při zvýšené teplotě
Tryp-N™ je termofilní enzym a může být použit při teplotách 55–65 °C. V aktuálním protokolu ProtiFi je jako standardní pracovní podmínka použita digesce při 55 °C po dobu 3 hodin.
Vyšší teplota současně:
- napomáhá rozvinutí a denaturaci proteinů,
- zpřístupňuje obtížně štěpitelná místa,
- omezuje aktivitu endogenních proteáz,
- omezuje aktivitu fosfatáz.
Řízení digesce pomocí EDTA
Protože Tryp-N™ patří mezi metaloproteázy, jeho aktivitu lze regulovat chelatací kovových iontů pomocí EDTA. To umožňuje:
- reprodukovatelně zastavit digesci,
- provádět kontrolované částečné štěpení,
- vytvářet překrývající se peptidy,
- zvýšit sekvenční pokrytí u vybraných aplikací.
Aktuální protokol uvádí pro ukončení in-solution digesce konečnou koncentraci přibližně 2,5–5 mM EDTA.
Doporučené podmínky digesce
Pro standardní postup s 1–100 µg proteinu protokol používá:
- množství vzorku: 1–100 µg celkového proteinu
- koncentrace dodávaného Tryp-N™: 0,5 mg/mL
- poměr enzym : protein: 1:50 (w/w)
- teplota digesce: 55 °C
- doba digesce: 3 hodiny
- bez třepání během inkubace
- volitelné ukončení digesce: 2,5–5 mM EDTA.
Kompatibilita se S-Trap™
Tryp-N™ lze použít také společně s ProtiFi S-Trap™ Micro Kit. Protein je nejprve zachycen a vyčištěn v S-Trap™ matrici a následně je do kolony přidán roztok Tryp-N™.
Pro 100 µg proteinu protokol používá 2 µg Tryp-N™, což odpovídá poměru enzym : protein 1:50. Digesce následně probíhá po dobu 3 hodin při 55 °C.
Technické specifikace
- Typ enzymu: termofilní metaloproteáza
- Použití: enzymatická digesce proteinů před MS
- Specificita: N-terminální štěpení před lysinem a argininem
- Fragmentační charakteristika: převaha b-iontů v MS/MS
- Optimální teplota: přibližně 65 °C
- Doporučené pracovní teploty: 55–65 °C
- Doporučená standardní digesce: 55 °C / 3 h
- Rozsah pH stability: přibližně 5–11
- Koncentrace dodávaného enzymu: 0,5 mg/mL
- Doporučený poměr enzym : protein: 1:50 (w/w)
- Typické množství vzorku: 1–100 µg proteinu
- Inhibice / ukončení aktivity: EDTA
- Doporučená koncentrace EDTA pro zastavení digesce: 2,5–5 mM
- Kompatibilní workflow: in-solution digest, S-Trap™
- Navazující techniky: LC-MS, LC-MS/MS, MRM
Složení Tryp-N™ Sequencing Grade Kit
PN K001-TRYPN-0010uG
- Tryp-N™ Sequencing Grade Enzyme: 10 µg
- Tryp-N™ Digestion Solution: 250 µL
PN K001-TRYPN-0020uG
- Tryp-N™ Sequencing Grade Enzyme: 20 µg
- Tryp-N™ Digestion Solution: 500 µL
PN K001-TRYPN-0100uG
- Tryp-N™ Sequencing Grade Enzyme: 100 µg
- Tryp-N™ Digestion Solution: 2 × 1,5 mL
Tryp-N™ Sequencing Grade Enzyme je dodáván v 50 mM trimethylamonium-acetátu s 2 mM CaCl₂ a 100 µM MnCl₂ ve vodě v kvalitě LC-MS.
Tryp-N™ Digestion Solution obsahuje 100 mM trimethylamonium-acetátu, pH 7,4 při 55 °C, 4 mM CaCl₂ a 200 µM MnCl₂. Produkt je přepravován na suchém ledu.
Typické aplikace
- Bottom-up proteomika
- LC-MS/MS proteomika
- Komplementární štěpení k trypsinu
- Lokalizace posttranslačních modifikací
- Fosfoproteomika
- De novo sekvenování
- MRM / cílená proteomika
- Zvýšení sekvenčního pokrytí proteinů
- Analýza obtížně štěpitelných proteinů
- Controlled / limited proteolysis
- S-Trap™ proteomická workflow
