ProtiFi Si-Trap™ 96-well Mini Kit je 96jamková sada pro multiomickou přípravu vzorků, která umožňuje z jednoho biologického vzorku separovat a zachytit různé třídy biomolekul pro následnou analýzu proteinů, metabolitů a lipidů. Systém je určen pro vzorky odpovídající 25–200 µg celkového proteinu na jamku a kombinuje separaci nízkomolekulárních látek s následným zpracováním zachycených proteinů přímo v Si-Trap™ destičce.
Na rozdíl od S-Trap™ workflow začíná Si-Trap™ rozpuštěním vzorku bez detergentů. Po neutralizaci a denaturaci organickým rozpouštědlem jsou proteiny zachyceny v derivatizované porézní matrici, zatímco metabolity a lipidy jsou získávány z průchozí frakce. Proteiny jsou následně přímo v destičce redukovány, alkylovány, promyty a enzymaticky štěpeny.
Princip technologie Si-Trap™
Si-Trap™ je navržen pro přípravu více omických frakcí z jednoho vzorku. Výchozí materiál se nejprve rozpustí bez detergentu. Po přidání vazebného roztoku jsou proteiny zachyceny prostřednictvím více slabých interakcí uvnitř derivatizovaných pórů Si-Trap™ matrice.
Nízkomolekulární složky zůstávají v průchozí frakci:
- metabolity jsou následně eluovány MS-kompatibilním roztokem,
- lipidy lze volitelně separovat po přidání Solution L a rozdělení kapalných fází,
- proteiny zůstávají zachyceny v destičce a pokračují do proteomického workflow.
Zachycené proteiny se přímo v matrici redukují a alkylují, promyjí a následně štěpí zvolenou proteázou. Vzniklé peptidy se eluují pro následnou LC-MS/MS analýzu.
Důležité: Si-Trap™ není v tomto ohledu totožný se S-Trap™. Výchozí vzorek pro aktuální Si-Trap™ 96-well Mini Kit nesmí obsahovat detergent.
Standardní multiomický postup
- Rozpuštění / lýza vzorku pomocí Si-Trap™ Lysis Solution A
- Případná sonifikace vzorku obsahujícího DNA
- Přidání Binding Solution A
- Volitelně přidání Solution L pro lipidomické workflow
- Přenesení vzorku do Si-Trap™ 96-well Mini Plate
- Zachycení proteinů v matrici
- Zachování průchozí frakce obsahující malé molekuly
- Eluce metabolitů
- Volitelná separace a odběr lipidové frakce
- Zakoncentrování metabolitové a případně lipidové frakce
- Redukce a alkylace proteinů přímo v destičce
- Promytí zachycených proteinů
- Přidání zvolené proteázy
- Digesce při 47 °C
- Eluce peptidů
- Příprava jednotlivých frakcí pro následnou MS analýzu.
Technické specifikace
- Formát: 96jamková destička + reagencie a příslušenství
- Určení: multiomická příprava vzorků
- Analyzované třídy biomolekul: proteiny/peptidy, metabolity, volitelně lipidy
- Rozsah vzorku: 25–200 µg celkového proteinu
- Kapacita jamky: přibližně 450 µL
- Standardní centrifugace: 2 000 × g / 2 min
- Alternativní způsob průtoku: vakuum nebo pozitivní tlak
- Předekvilibrace destičky: není nutná
- Redukce a alkylace: 80 °C / 30 min
- Promývání proteinů: 250 µL Wash Solution, 3×
- Objem proteázového roztoku: 125 µL
- Doporučený poměr trypsinu k proteinu: 1:10 (w/w)
- Digesce: 1–2 h při 47 °C
- Peptidová eluce 1: 80 µL Digestion Solution
- Peptidová eluce 2: 80 µL Elution Solution
- Volitelná eluce hydrofobních peptidů: 80 µL 50% ACN / 0,2% kyselina mravenčí
- Navazující analýza: LC-MS / LC-MS/MS
Obsah kitu
PN K006-96MNI-0001KT obsahuje:
- 1× Si-Trap™ 96-well Mini Plate
- 1× 2,0mL 96-well Waste Plate
- 2× 1,0mL 96-well Collection Plate
- 2× Silicone Mat
- Solution 1 – Lysis Solution A: 2 × 2,5 mL
- Solution 2 – Binding Solution A: 1 × 5,0 mL
- Solution 3 – Metabolite Elution Solution: 1 × 26,0 mL
- Solution 4 – Reductant/Alkylator:
- Solution 4B: 1 × 5,0 mL
- Solution 4A: 1 × 300 µL
- Solution 4R: 1 × 500 µL
- Solution 5 – Wash Solution: 3 × 26,0 mL
- Solution 6 – Digestion Solution: 1 × 30,0 mL
- Solution 7 – Elution Solution: 1 × 8,0 mL.
Co není součástí kitu
- proteáza podle volby uživatele, např. trypsin,
- voda v kvalitě LC-MS,
- acetonitril v kvalitě LC-MS,
- kyselina mravenčí v kvalitě LC-MS.
Pro izolaci lipidové frakce je navíc nutná Si-Trap™ Solution L – Lipid Elution Solution, která není součástí kitu a prodává se samostatně.
Uchovávání
- Si-Trap™ 96-well Mini Plate: až 1 rok při 4 °C
- Solution 1: až 1 rok při pokojové teplotě, v těsně uzavřeném obalu; nezahřívat
- Ostatní dodávané roztoky: až 1 rok při −20 °C
Po rozmrazení při 4 °C je třeba roztoky důkladně promíchat, aby se případné precipitáty znovu rozpustily.
