ProtiFi S-Trap Midi Spin Columns pro přípravu proteomických vzorků

ProtiFi S-Trap™ Midi Spin Columns jsou centrifugační kolonky pro přípravu proteinových vzorků před LC-MS/MS analýzou. Varianta Midi umožňuje zpracovat až 1 mg celkového proteinu a využívá patentovanou technologii S-Trap™ pro solubilizaci proteinů pomocí SDS, jejich redukci, alkylaci, zachycení, odstranění kontaminujících látek a následnou enzymatickou digesci přímo v koloně. 

Princip technologie S-Trap™

Proteinový vzorek je nejprve solubilizován a denaturován v roztoku obsahujícím SDS. Následuje redukce, alkylace a acidifikace na pH ≤1. Po přidání Binding/Wash Solution obsahujícího 90% methanol jsou proteiny zachyceny v matrici S-Trap™. 

Kolona se následně promývá methanolovým Binding/Wash Solution, čímž se odstraní látky nevhodné pro následnou LC-MS analýzu. Po vyčištění se přímo na matrici aplikuje proteáza a proběhne enzymatická digesce. Vzniklé peptidy se poté postupně eluují a mohou být po zakoncentrování použity pro další LC-MS/MS analýzu.

Standardní workflow

1. Solubilizace a denaturace proteinů
2. Redukce pomocí TCEP
3. Alkylace pomocí MMTS
4. Okyselení na pH ≤1
5. Přidání vazebného/promývacího roztoku
6. Zachycení proteinů v S-Trap™ Midi Spin Column
7. Promytí a odstranění kontaminantů
8. Přidání zvolené proteázy
9. Digesce 1–2 hodiny při 47 °C
10. Postupná eluce peptidů
11. Lyofilizace nebo zakoncentrování ve SpeedVac a příprava pro LC-MS/MS

Technické specifikace

• Formát: centrifugační kolonka
• Určení: příprava proteomických vzorků
• Maximální množství celkového proteinu: ≤1 mg
• Doporučená proteáza: dle aplikace, např. trypsin nebo Trypsin/Lys-C
• Poměr proteázy k proteinu: 1:10 až 1:100 (w/w)
• Standardní centrifugace při zachycení proteinu: 4 000 × g / 30 s
• Maximální centrifugace při nedostatečném průtoku: až 8 000 × g / 5 min
• Promývání: 3,0 mL Binding/Wash Solution, 3×
• Objem digesčního roztoku: 350 µL
• Digesce: 1–2 h při 47 °C
• První eluce: 500 µL Digestion Solution
• Druhá eluce: 500 µL Elution Solution
• Volitelná třetí eluce: 500 µL Elution Solution 2 pro hydrofobní peptidy
• Způsob průtoku: centrifugace; volitelně vakuum nebo pozitivní tlak
• Navazující analýza: LC-MS / LC-MS/MS
• Určení: Research Use Only – není určeno pro diagnostické postupy

Reagencie používané v S-Trap™ postupu

Aktuální protokol uvádí následující roztoky:

• Solution 1 – 2× Lysis Solution: 10% SDS, 100 mM TEAB, pH 7,55
• Solution 2 – Reductant: 120 mM TCEP
• Solution 3 – Alkylator: 500 mM MMTS v IPA
• Solution 4 – Acidifier: 12% kyselina fosforečná
• Solution 5 – Binding/Wash Solution: 100 mM TEAB v 90% methanolu, pH 7,5
• Solution 6 – Digestion Solution: 50 mM TEAB, pH 8,0
• Solution 7 – Elution Solution: 0,2% kyselina mravenčí ve vodě
• Solution 8 – Elution Solution 2: 50% ACN v 0,2% kyselině mravenčí, volitelně pro hydrofobní peptidy.

Reagencie ani proteáza nejsou součástí balení samotných S-Trap™ Midi Spin Columns. Pro aktuální protokol ProtiFi doporučuje používat reagencie v kvalitě LC-MS, kde je to relevantní.

Dostupné varianty

• PN C002-MIDIX-0010PK – 10× S-Trap™ Midi Spin Column
• PN C002-MIDIX-0020PK – 20× S-Trap™ Midi Spin Column
• PN C002-MIDIX-0040PK – 40× S-Trap™ Midi Spin Column