Evaluating the Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Proteins

Význam tématu

Size-exclusion chromatography (SEC) je klíčovou technikou pro analýzu nekovalentních agregátů a fragmentů proteinů, zvláště bioterapeutických monoklonálních protilátek. Přesnost metody významně ovlivňuje extra-column disperze v LC systému, která v závislosti na objemech kapilár a spojů narušuje rozlišení a citlivost. Pro optimalizaci analytických metod je nezbytné toto šíření kvantifikovat a minimalizovat.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo systematicky popsat původ, měření a dopad extra-column disperze na efektivitu SEC separací proteinových vzorků. Studie navazuje na předchozí aplikační poznámku věnovanou optimálním konfiguracím kolonek pro protilátky a rozšiřuje ji obecnou diskusí a praktickými daty pro různé vnitřní průměry, délky a velikosti částic SEC kolonek.

Použitá metodika a instrumentace

Pro určení objemu extra-column disperze bylo využito měření šířky rychlých injekcí standardu (kofeinu, uracilu nebo bílkovinných standardů) bez kolonky a při různých přídavných smyčkách.

• LC systémy: ACQUITY UPLC H-Class Bio, ACQUITY Arc Bio, Alliance HPLC
• Detektor: ACQUITY UPLC TUV (280 nm), objem průtokové kyvety 5 mm
• Kolonky: ACQUITY UPLC Protein BEH SEC (1.7 µm, 2.1/4.6 × 150/300 mm), XBridge Protein BEH SEC (2.5–3.5 µm, 4.6–7.8 × 150/300 mm)
• Software: Empower 3

Hlavní výsledky a diskuse

Extra-column disperze (5σec) rostla s vnitřním průměrem a délkou kapilár, přičemž turbulační přechodové objemy na rozhraních dále přispívaly k roztažení píků. Měření šířky píků na 4.4 % výšky poskytlo reprodukovatelné odhady 5σec. Srovnání systémů ukázalo rozsah 8–66 µL 5σec. Při rostoucí disperzi klesá účinnost (N) i rozlišení (Rs) zejména u úzkých (2.1 mm) a krátkých (150 mm) kolonek s částicemi 1.7 µm, kde je objem píků pouze 2–3× vyšší než 5σec. Větší (4.6, 7.8 mm) nebo delší (300 mm) kolonky a větší částice (2.5, 3.5 µm) snižují relativní vliv disperze a stabilizují výsledné rozlišení.

Přínosy a praktické využití metody

Prakticky to znamená:

• Při nízké disperzi (≤25 µL) volit 4.6 mm I.D. kolonky s 1.7 µm pro maximální rozlišení.
• Při vyšší disperzi (>40 µL) preferovat 7.8 mm I.D. s 2.5 µm částicemi pro lepší robustnost a citlivost.
• Úsporu mobilní fáze a vzorku zajistí menší I.D. a nižší průtok, avšak za cenu citlivosti na disperzi.

Budoucí trendy a možnosti využití

Dalším směrem je vývoj systémů s ultra-nízkou disperzí (5σec < 10 µL) a nových pevnostních materiálů, které by umožnily použití úzkých SEC kolonek s velmi malou částicí bez ztráty rozlišení. Integrace s MS a AI-řízené metody optimalizace spojů a převodů umožní rychlé, automatizované ladění disperze pro různé aplikace.

Závěr

Extra-column disperze zásadně ovlivňuje kvalitu SEC analýzy proteinů, zejména u vysoce účinných a úzkých kolonek. Systematické měření a řízení této disperze v kombinaci s vhodnou volbou průměru kolonek, délky a velikosti částic poskytuje optimální kompromis mezi rozlišením, citlivostí a provozní robustností.

Reference

1. Hong P. et al. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2012, 35, 2923–50
2. Goyon A. et al. J. Pharm. Biomed. Anal. 2017, 35, 50–60
3. Fountain K.J. et al. J. Chromatogr. A 2009, 1216, 5979–88
4. Grinias J.P. et al. J. Chromatogr. 2015, 2, 669–90
5. Vanderheyden Y. et al. J. Chromatogr. A 2016, 1440, 74–84
6. Vanderheyden Y. et al. J. Chromatogr. A 2016, 1465, 126–42
7. Vanderheyden Y. et al. J. Chromatogr. A 2014, 1364, 140–50
8. Spaggiari D. et al. J. Chromatogr. A 2013, 1310, 45–55