GPC/SEC
ZaměřeníFarmaceutická analýza
VýrobceWaters
Význam tématu
Size-exclusion chromatography (SEC) je klíčová pro kontrolu kvality bioterapeutik, zejména monoklonálních protilátek (mAb). Separace vysokomolekulárních agregátů (HMWS) a nízkomolekulárních fragmentů (LMWS) zajišťuje bezpečnost, účinnost a stabilitu léčiv. Zvýšené nároky na přesnost kvantifikace fragmentů (např. hmota kolem 100 kDa) vyžadují optimalizaci chromatografického systému včetně minimalizace systémové disperze.
Cíle a přehled studie
Hlavním cílem bylo systematicky analyzovat vliv extra-column dispersion na rozlišení a kvantifikaci HMWS a LMWS monoklonálních IgG protilátek. Studie porovnala SEC kolony s různou velikostí částic (1,7 µm, 2,5 µm, 3,5 µm), vnitřním průměrem 4,6 mm a 7,8 mm a délkou 150 mm či 300 mm. Hodnocena byla výkonnost na LC systémech s různými hodnotami 5σ systémové disperze.
Použitá metodika a instrumentace
Ultrarychlé a vysokotlaké LC systémy
- ACQUITY UPLC H-Class Bio
- ACQUITY Arc Bio
- Alliance HPLC
- ACQUITY UPLC Protein BEH SEC 200 Å (1,7 µm)
- XBridge Protein BEH SEC 200 Å (2,5 µm, 3,5 µm)
- BEH SEC 200 Å vlastnoručně balené (3,5 µm)
- UV detektor TUV při 280 nm
- Software Empower 3
Složení: fosfátový pufr s NaCl (pH≈6,8–7,2); průtok a objem injekce upraven podle ID kolony.
Hlavní výsledky a diskuse
Měření systémové disperze pomocí 5σec (šířka píku při 4,4 % výšky) prokázalo asymetrické rozšiřování. Zvýšení 5σec vedlo k poklesu rozlišení, zvláště u fragmentů LMWS1, které elutují jako rameno hlavní monomerní špičky.
Pro HMWS (≈300 kDa) zůstalo rozlišení stabilní na většině kolonu za podmínky Rs>1,6. Rozlišení LMWS1 (≈100 kDa) nejvíce závisí na poměru objemu píku k objemu disperze:
- Kolona 4,6×300 mm (1,7 µm) dosáhla nejvyššího rozlišení při 5σec≤25 µl (P/V≈1,3–1,6). Při vyšší disperzi výrazně klesá.
- Kolona 7,8×300 mm (2,5 µm) poskytla stabilní rozlišení i při 5σec až 45 µl a méně závisí na disperzi; dosahuje srovnatelné nebo lepší P/V než 1,7 µm kolona na střední disperzi.
- Kolona 7,8×300 mm (3,5 µm) vykázala nižší rozlišení LMWS1, ale nejnižší tlak – vhodné pro systémy s omezenou kapacitou tlaku.
Strategie pro lepší rozlišení zahrnují prodloužení kolony (300→600 mm), snížení průtoku nebo zapojení dvou kolonu v sérii. Kompromis mezi časem analýzy, objemem mobilní fáze a citlivostí je klíčový.
Přínosy a praktické využití metody
Studie poskytuje konkrétní doporučení pro volbu SEC kolony na základě měřené hodnoty 5σ systémové disperze:
- 5σ≤12 µl: kolona 4,6×300 mm (1,7 µm)
- 12–25 µl: 4,6×300 mm (1,7 µm) nebo 7,8×300 mm (2,5 µm)
- 25–45 µl: 7,8×300 mm (2,5 µm)
- >45 µl: 7,8×300 mm (2,5 µm) nebo 7,8×300 mm (3,5 µm) pro nižší tlak
Budoucí trendy a možnosti využití
Vzestup 2,5 µm BEH SEC materiálů kombinuje vyšší rozlišení se snazším provozem na středně disperzních systémech. Očekává se rozšíření kolonu s větší délkou, automatická kompenzace disperze a optimalizace pro vysokopropustné screeningové aplikace. Doporučuje se soustavné měření disperze a její zapojení do validace SEC metod i pro jiné třídy proteinů.
Závěr
Metoda zdůrazňuje nezbytnost sladění systémové disperze LC a konstrukce kolony pro spolehlivou analýzu mAb agregátů a fragmentů. Správná volba částic, ID a délky kolony minimalizuje vliv disperze a umožňuje reprodukovatelné kvantifikace nízkých podílů LMWS.
Reference
1. Hong P et al Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates J Liq Chrom Rel Technol 2012 35 2923–50
2. Cordoba AJ et al Non-Enzymatic Hinge Region Fragmentation of Antibodies J Chromatogr B 2005 818 115–21
3. Goyon A et al The importance of System Band Broadening in Modern Size Exclusion Chromatography J Pharm Biomed Anal 2017 135 50–60
4. Smith MA et al Specific Cleavage of Immunoglobulin G by Copper Ions Int J Pept Protein Res 1996 48 48–55
Obsah byl automaticky vytvořen z originálního PDF dokumentu pomocí AI a může obsahovat nepřesnosti.
