DEVELOPMENT OF A SPE LC-MS/MS METHOD FOR THE BIOANALYTICAL QUANTIFICATION OF PRAMLINTIDE FROM SERUM

Význam tématu

Pramlintide je syntetický analog hormonu amylin, využívaný jako doplňková léčba diabetu 1. a 2. typu. Kromě diabetologických indikací se ukazuje jeho potenciál v modelování Alzheimerovy choroby, což zvyšuje potřebu citlivých analytických metod pro měření nízkých koncentrací pramlintidu v biologických vzorcích. Hydrofobní povaha peptidu však ztěžuje jeho analýzu kvůli nespecifické adsorpci na běžné laboratorní materiály.

Cíle a přehled studie

Cílem práce bylo vyvinout a optimalizovat selektivní SPE-LC-MS/MS metodu pro kvantifikaci pramlintidu z 100 µl lidské a potkaní sérum s dolní hranicí kvantifikace (LLOQ) 25 pg/ml. Studie se zaměřila na zlepšení výtěžnosti extrakce, snížení potlačení matrice a dosažení vysoké přesnosti a opakovatelnosti v širokém dynamickém rozsahu.

Použitá metodika a instrumentace

Sample preparation:

• Vzorek 100 µl séra naředěn vodou (1:1) a aplikován na 96-well WCX µElution SPE destičky.
• Podmínění sorbentu metanolem a vodou, praní vodou a 20 % acetonitrilem ve vodě.
• Eluce pramlintidu s 1 % TFA v 75:25 acetonitril:voda, sběr ve QuanRecovery 96-well destičkách s MaxPeak HPS.

Chromatografie a detekce:

• UPLC systém ACQUITY I-Class PLUS s Peptide CSH C18 kolonou (1,7 µm, 2,1×50 mm) při 0,4 ml/min.
• Lineární gradient mobilní fáze (0,1 % FA ve vodě a acetonitrilu), optimalizovaný start na 20 % B a pomalé přechody 22–27 % B v 3 minutách.
• Tandemový kvadrupólový MS Xevo TQ-XS v režimu ESI+, MRM přechody 988,36 > 968,11 a 988,36 > 930,78 pro kvantifikaci.

Hlavní výsledky a diskuse

- Optimalizované WCX SPE zvýšilo výtěžnost pramlintidu na ~75 %.
- MaxPeak HPS povrchy snížily nespecifickou vazbu peptidu, což vedlo k 36násobnému nárůstu signálu v čistém roztoku.
- Úprava chromatografického gradientu minimalizovala potlačení matrice a chromatografické interference.
- Kalibrační křivky pro rozsah 25–50 000 pg/ml byly lineární (r2 > 0,995) s přesností 91–111 % a RSD < 5 %.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda umožňuje vysoce citlivou, přesnou a reprodukovatelnou kvantifikaci pramlintidu z malých objemů séra, což je klíčové pro farmakokinetické studie, preklinický výzkum a monitorování léčby. Díky robustnímu vzorkovacímu protokolu a optimalizované chromatografii je metoda vhodná pro rutinní analýzu v bioanalytických laboratořích.

Budoucí trendy a možnosti využití

- Adaptace protokolu na další hydrofobní peptidy a peptidové léky.
- Další miniaturizace a automatizace SPE formátů pro vysokoprůchodové studie.
- Integrace s ultrarychlou chromatografií a vysokorozlišovacími MS systémy pro širší spektrum aplikací.
- Využití v neurovědách, např. studium amylinu v neurodegenerativních onemocněních.

Závěr

Byla úspěšně vyvinuta první publikovaná SPE-LC-MS/MS metoda pro kvantifikaci pramlintidu v séru, která dosahuje LLOQ 25 pg/ml z 100 µl vzorku. Kombinace WCX SPE, MaxPeak HPS destiček, optimalizované chromatografie a citlivé tandemové MS detekce zajišťuje vysokou citlivost, selektivitu a reprodukovatelnost.

Reference

1. Center for Drug Evaluation and Research Approval Package, FDA, 2019.
2. SYMLIN Product Information, Drugs.com, 2019.
3. Mohamed L.A. et al., J. Alzheimers Dis. 2017, 56(3), 1087–1099.
4. Rabe M. et al., Adv. Colloid Interface Sci. 2011, 162(1–2), 87–106.