DEVELOPMENT OF A SPE LC-MS/MS METHOD FOR THE BIOANALYTICAL QUANTIFICATION OF PRAMLINTIDE FROM SERUM

Význam tématu

Pramlintide je syntetický analog hormonu amylinu používaný jako doplňková terapie u pacientů s diabetem 1. a 2. typu. Díky své hydrofobicitě se analyzovaný peptid váže nespecificky na povrchy labware, což ztěžuje bioanalytické stanovení a snižuje výtěžnost a citlivost metody. Rostoucí zájem o roli amylinu v modelu Alzheimerovy choroby podtrhuje potřebu spolehlivých kvantifikačních postupů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem tohoto výzkumu bylo vyvinout a optimalizovat selektivní přípravu vzorku a LC-MS/MS metodu schopnou detekovat pramlintide v koncentracích až 25 pg/mL z pouze 100 µL lidského či potkaního séra. Studie zahrnuje vyladění SPE protokolu, chromatografických podmínek a parametrů hmotnostní spektrometrie, aby byla zajištěna vysoká citlivost, přesnost a reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

• Odběr a příprava vzorků: 100 µL lidského nebo potkaního séra obohaceného pramlintidem.
• SPE extrakce: OASIS WCX μElution 96-well deska. Praní vodou a 20 % acetonitrilem. Eluce 1 % TFA v poměru 75 : 25 ACN : H₂O (25 µL), následné doplnění na 50 µL vodou.
• Chromatografie: ACQUITY UPLC I-Class PLUS s kolonkou Peptide CSH C18 (2.1×50 mm, 1.7 µm, 60 °C). Gradient mobilní fáze B (0.1 % kyselina mravenčí v ACN) z 20 → 27 % v 3 minutách.
• Hmotnostní spektrometrie: Xevo TQ-XS v režimu MRM s přechody 988.36→968.11 ([3H+]3) a 988.36→930.78 ([4H+]4). Napětí kapiláry 1.0 kV, konové napětí 15 V, desolvační teplota 600 °C, doba cyklu 7 minut, objem injekce 10 µL.

Hlavní výsledky a diskuse

• Protokol WCX SPE snížil nespecifické vazby a umožnil výtěžnost pramlintidu až ~75 %.
• QuanRecovery desky s MaxPeak HPS zvýšily signál až 36× oproti standardnímu polypropylenu.
• Lineární rozsah detekce 25–50 000 pg/mL. Kalibrační křivky měly r² > 0.995 a přesnost 91–111 % (lidské sérum) a 92–106 % (potkaní sérum).
• QC vzorky vykázaly RSD < 5 % pro všechny úrovně koncentrací.
• Optimalizované chromatografické gradienty významně omezily potlačení matrice a interferenční signály.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda představuje první publikovaný postup pro kvantifikaci pramlintidu ve pg/mL oblasti z malých objemů séra. Díky jednoduché přípravě vzorku a robustnímu UPLC-MS/MS rozlišení je vhodná pro farmakokinetické a toxikologické studie, výzkum Alzheimerovy choroby či rutinní QA/QC v biopharmaceutickém průmyslu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Multiplexní analýzy společně s dalšími peptidy a biomarkery.
• Automatizace a miniaturizace přípravy vzorků pro vysokopropustné platformy.
• Rozšíření aplikace na klinické farmakokinetické studie a sledování účinnosti léčby amylinovými agonisty.

Závěr

Vyvinutá SPE-LC-MS/MS metoda dosahuje vysoké citlivosti (LLOQ 25 pg/mL), přesnosti a reprodukovatelnosti při minimálním objemu vzorku. Kombinace WCX SPE, QuanRecovery HPS desek a optimalizované chromatografie umožňuje spolehlivou kvantifikaci pramlintidu v lidském i potkaním séru, podporující další farmakologické a klinické studie.

Reference

• Dunning CM, Lame ME, Wrona MD, Haynes K. Development of a SPE LC-MS/MS Method Utilizing QuanRecovery Sample Plates with MaxPeak Performance Surfaces for the Bioanalytical Quantification of Pramlintide from Serum. Waters Application Note 720006527en, March 2019.
• Center for Drug Evaluation and Research. Approval Package for Application Number 21–332: Clinical Pharmacology and Biopharmaceutics Review. FDA, January 2019.
• Rabe M, Verdes D, Seeger S. Understanding Protein Adsorption Phenomena at Solid Surfaces. Advances in Colloid and Interface Science. 2011;162(1-2):87–106.