COMPLETE AUTOMATED WORKFLOW FOR COMPARING THE N-GLYCAN PROFILE OF INNOVATOR AND BIO-SIMILAR INFLIXIMAB SAMPLES

Význam tématu

Analýza N-glykanových profilů terapeutických protilátek, jako je infliximab, je zásadní pro zajištění kvality, účinnosti a bezpečnosti biosimilárních i originálních přípravků. Glykoanalýza pomáhá identifikovat rozdíly v glykosylaci, které mohou ovlivnit imunogenitu a farmakokinetiku bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Studie popisuje kompletně automatizovaný pracovní postup pro srovnání N-glykanového profilu originálního (innovator) a biosimilárního infliximabu. Hlavními cíli bylo:

• Optimalizovat přípravu vzorku s využitím robotizovaného pipetovacího pracoviště Andrew Alliance doplněného o řízené vakuum.
• Nasadit LC-MS systém BioAccord (ACQUITY UPLC I-Class Plus + RDa ToF detektor) pro robustní separaci a detekci glykanů.
• Automatizovat zpracování dat a reportování výsledků v softwaru UNIFI.
• Srovnat glykánové vzory originálních a biosimilárních vzorků infliximabu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu glykanů byla využita komerčně dostupná sada GlycoWorks RapiFluor-MS dle protokolu publikovaného v SLAS Technology. Klíčové kroky:

• Enzymatické uvolnění N-glykanů, označení fluorescentním činidlem RapiFluor-MS a čištění na µElution destičce.
• Automatizované pipetování v robotickém systému Andrew Alliance s integrovaným vakuovým modulem a tepelnou regulací.
• Chromatografická separace na kolóně ACQUITY Glycan BEH Amide (1.7 µm, 2.1×150 mm) s gradientem amoniového formiátu a acetonitrilu.
• Detekce pomocí ACQUITY FLR detektoru (excitace 265 nm, emise 425 nm) a RDa ToF MS (ESI+, 0–2000 m/z, kontinuální sběr dat, CID fragmentace).
• Informatika: UNIFI Scientific Information System s Glycan Application Solution pro kalibraci retenčních časů (GU), identifikaci glykoform a generování reportů.

Hlavní výsledky a diskuse

Reprodukovatelnost systému byla demonstrována sledováním tří vybraných glykoform přes 20 po sobě jdoucích injekcí, s minimální variabilitou relativních abundancí.

Porovnání originálního a biosimilárního infliximabu ukázalo:

• 25 automaticky identifikovaných glykoform s hmotnostní tolerancí <10 ppm.
• Vysokou shodu N-glykanových profilů mezi dvěma originálními vzorky.
• Odlišný poměr sialylovaných forem u biosimilárního vzorku, potvrzený přímým překryvem chromatogramů a sumarizačními grafy.
• Simultánní sběr MS/MS dat zvýšil jistotu při přiřazování strukturálně podobných izobarických glykanů.

Přínosy a praktické využití metody

Automatizované řešení integruje přípravu vzorku, chromatografickou separaci, MS detekci a automatizované vyhodnocení dat. Výhody:

• Minimalizace manuálních zásahů a lidské chyby.
• Zkrácení doby protokolu díky paralelním krokům (vysušení, eluce, pipeline měření).
• Konzistentní a reprodukovatelné výsledky vhodné pro rutinní QA/QC laboratorní provoz.
• Integrované generování reportů usnadňuje sdílení a archivaci výsledků.

Budoucí trendy a možnosti využití

Lze očekávat další rozšíření robotických platforem s pokročilou vakuovou a termickou kontrolou pro širší spektrum analytických protokolů. Integrace s AI-podporovanými algoritmy pro prediktivní analýzu glykanových struktur slibuje rychlejší interpretaci dat. Multiparametrické platformy kombinující glykoanalýzu s dalšími post-translačními modifikacemi (např. glykozaminoglykany) mohou podpořit komplexní profilování bioterapeutik.

Závěr

Prezentovaný plně automatizovaný workflow významně zjednodušuje a standardizuje analýzu N-glykanových profilů bioterapeutik. Kombinace robotické přípravy vzorku, robustního LC-MS systému BioAccord a pokročilého zpracování dat v UNIFI poskytuje spolehlivou platformu pro srovnávací studie originálních a biosimilárních produktů.

Reference

1. Zhang X., Reed C. E., Shion H. et al. Released N-linked Glycan Analysis Using the BioAccord System. Waters Corporation, 2019.
2. Reed C. E., Fournier J., Vamvoukas N. et al. Automated Preparation of MS-Sensitive Fluorescently Labeled N-Glycans with a Commercial Pipetting Robot. SLAS Technology 2018; 2472630318762384.