Meeting the Challenges of Implementing Accurate-Mass Mass Spectrometry for Biotherapeutic Development in Regulated/non-Regulated Environments

Význam tématu

Implementace přesnohmotnostní hmotnostní spektrometrie (MS) je klíčová pro charakterizaci bioterapeutik, kde je nutná vysoká přesnost měření hmotnosti proteinů, peptidů a glykanů. V biovývoji a kvalitativní kontrole pomáhá odhalit drobné modifikace, degradační produkty nebo heterogenitu, což je zásadní pro zajištění bezpečnosti a účinnosti léčiv.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo vyvinout a ověřit novou stolní platformu BioAccord, založenou na ortogonálním zrychlení TOF MS, která umožní automatizovanou, přesnou a reprodukovatelnou analýzu bioterapeutik v regulovaných i neregulovaných prostředích. Studie zahrnuje tři hlavní pracovní postupy:

• Intaktní hmotnostní analýza monoklonálních protilátek
• Podjednotková analýza po enzymatické štěpnici (IdeS)
• Peptidové mapování a uvolněné N-glykany s RFMS značením

Použitá metodika a instrumentace

Pro všechny analýzy byla využita systémová konfigurace Waters ACQUITY UPLC spojená s detektory TUV pro intact/subunit/peptidové studie nebo FLR pro glykanovou analýzu a oa-TOF MS (Acquity RDa). K separacím sloužily:

• C4 kolona pro intact a subunit analýzu (1,7 µm, 2,1×50 mm)
• SEC 200 Å kolona pro nativní SEC/MS (2,1×150 mm)
• C18 BEH pro peptidové mapování (2,1×100 mm)
• Glykan Amide pro uvolněné glykany (2,1×150 mm)

Příprava vzorků:

• Ředění mAb v 25 mM NH4OAc (0,1 µg/µL až 1 ng/µL)
• Enzymatická štěpnice IdeS pro subunit analýzu
• Trypsinové štěpení s redukcí a alkylací pro peptidové mapování
• Glycanová příprava s Waters GlycoWorks RapiFlour-MS kitem

Pro sběr dat byl použit režim MS a DIA, zpracování a reportování probíhalo v compliance-ready platformě UNIFI.

Hlavní výsledky a diskuse

Intaktní analýza NIST mAb prokázala konzistentní relativní procentuální zastoupení hlavních glykoforem při RSD < 4 % napříč 321 injekcemi. Podjednotková analýza odhalila až tři oxidované formy pro hlavní scFc i F(ab) subjednotku.
ADC vzorky (trastuzumab emtansine) ukázaly shodu distribučních profilů nábojového stupně (DAR) mezi LC-SEC/MS dekonvolucí a tradiční HIC analýzou. Peptidové mapování dosáhlo vysokého pokrytí sekvence s vynikající přesností m/z pro prekurzory i fragmenty. Analýza uvolněných glykánů potvrdila 28 struktur, z nichž 19 mělo zastoupení > 0,1 %, detekce glykanu F(6)A2[6]G(4)1Sg(6)1 byla možná i při 0,09 % s S/N 30:1.

Přínosy a praktické využití metody

• Plně automatizovaný pracovní postup od akvizice po report
• Vysoká opakovatelnost a přesnost měření intact, subunit a glykanových analýz
• Uživatelsky přívětivé ovládání vhodné pro méně zkušené MS operátory
• Compliance-ready platforma vhodná pro regulovaná prostředí (GxP)

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření platformy do rutinních QC laboratoří pro bioterapeutika, integrace pokročilých algoritmů pro DIA analýzu a strojového učení pro predikci modifikací. Dále se uplatní v online monitorování bioprodukce a miniaturizaci analytických přístrojů pro vyšší throughput.

Závěr

BioAccord LC/MS systém prokázal vysoký výkon, snadnost obsluhy a reprodukovatelnost napříč klíčovými workflow bioterapeutického vývoje. Komplexní a automatizované řešení umožňuje širší adopci přesnohmotnostní MS v regulovaných i neregulovaných laboratořích.

Reference

1. Shion H., Ranbaduge N., Zhang X. et al. Meeting the Challenges of Implementing Accurate-Mass Mass Spectrometry for Biotherapeutic Development. Waters Corporation, 2019.