ACQUISITION MODE CHARACTERIZATION FOR THE QUANTITATIVE AND QUALITATIVE ANALYSIS OF CROSS-LINKED PEPTIDES BY TARGETED AND UNTARGETED LC-IM-MS

Význam tématu

Cross-linking masová spektrometrie (XLMS) je klíčová metoda pro zkoumání prostorové struktury proteinů a proteinových komplexů, přinášející cenné strukturální informace v systémech obtížně přístupných tradičním vysokorozlišovacím technikám.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo systematicky porovnat kvantitativní a kvalitativní výkon různých režimů akvizice LC-IM-MS (metody PRM, DIA, DDA) při analýze cross-linkovaných peptidů na platformě quadruple oa-ToF s IMS.

Použitá metodika a instrumentace

• kapalinová chromatografie: Waters AQUITY I-Class s kolonkou HSS T3 a M-Class s BEH C18
• masová spektrometrie: Synapt G2-Si s ion mobility (IM), režimy MS, HDMS, DDA, HDDDA, TofMRM, MSE, HDMSE, SONAR
• ETD fragmentace s 4-nitrotoluenem jako reagens
• datová analýza: Skyline-daily, MassLynx, vlastní Python skripty

Hlavní výsledky a diskuse

Inkluze IMS významně zvýšila citlivost až 10× a snížila interferenci produktových iontů. Izotopická korekce navýšila dynamický rozsah v průměru o 35 % zejména u metod HDMSE. Nejnižší LLOD a nejširší dynamický rozsah prokazovaly PRM a DIA přístupy s IMS. Metoda Hi(n) umožnila odhad stoichiometrie XL-BSA, ETD poskytlo téměř úplné pokrytí peptidové sekvence.

Přínosy a praktické využití metody

• vysoká citlivost a selektivita detekce cross-linkovaných peptidů
• možnost absolutní i relativní kvantifikace ve složitých biologických matricích
• získání strukturální informace z kolizně orientovaných ploch a ETD fragmentace

Budoucí trendy a možnosti využití

• další integrace IMS pro hloubkovou strukturální analýzu proteinů
• vylepšení bioinformatických nástrojů pro automatizovanou identifikaci XL peptidů
• standardizace kvantitativních protokolů pro rutinní aplikace
• rozšíření na nové cross-linkery a biologické vzorky

Závěr

Studie potvrdila, že IMS a isotopické korekce významně zlepšují kvantitativní a kvalitativní analýzu cross-linkovaných peptidů. PRM a DIA metody s IMS se ukázaly jako nejúčinnější, ETD poskytuje detailní sekvenční informace a Hi(n) kvantifikace umožňuje odhad stoichiometrie.

Reference

1. James et al. Optimization Workflow for the Analysis of Cross-Linked Peptides Using a Quadrupole Time-of-Flight Mass Spectrometer. Anal Chem. 2019;91(3):1808-1814.
2. Lermyte et al. ETD allows for native surface mapping of a 150 kDa noncovalent complex on a commercial Q-TWIMS-TOF instrument. J Am Soc Mass Spectrom. 2014;25(3):343-350.
3. Helm et al. Ion mobility tandem mass spectrometry enhances performance of bottom-up proteomics. Mol Cell Proteomics. 2014;13(12):3709-3718.
4. Daly et al. Qualitative and quantitative characterization of plasma proteins when incorporating traveling wave ion mobility into a liquid chromatography-mass spectrometry workflow for biomarker discovery. Anal Chem. 2014;86(4):1972-1979.
5. Silva et al. Absolute quantification of proteins by LCMSE: a virtue of parallel MS acquisition. Mol Cell Proteomics. 2006;5(1):144-156.
6. Switzar et al. In-Depth Characterization of Protein Disulfide Bonds by Online Liquid Chromatography-Electrochemistry-Mass Spectrometry. J Am Soc Mass Spectrom. 2016;27(1):50-58.