High-Throughput In Vitro ADME Analysis with Agilent RapidFire/MS Systems: Cytochrome P450 Inhibition

Význam tématu

Analýza inhibice cytochromu P450 je klíčová pro hodnocení možných interakcí mezi léčivy a predikci nežádoucích účinků v raných fázích vývoje. Díky přesunu in vitro ADME testování do dřívějších stadií roste potřeba metod umožňujících rychlou a nákladově efektivní analýzu velkého objemu vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo porovnat výkon systému Agilent RapidFire/MS s tradičními LC/MS/MS metodami při měření IC50 hodnot inhibice různých CYP izoenzymů v přímých i časově závislých experimentech na lidských jaterních mikrozomech.

Použitá instrumentace

Systém Agilent RapidFire/MS ve spojení s triple kvadrupólovým (QQQ) nebo TOF hmotnostním spektrometrem. Pro referenční měření byly použity konvenční LC/MS/MS přístroje.

Použitá metodika

Experimenty probíhaly s FDA doporučenými substráty a standardními sedmibodovými koncentracemi inhibitorů. Pro přímé měření IC50 se prováděly jednorázové inkubace lidských jaterních mikrozomů se stabilně značenými vnitřními standardy. U časově závislé inhibice byly vzorky předinkubovány s NADPH a následně testovány stejným způsobem.

Hlavní výsledky a diskuse

Srovnání RapidFire/MS a tradiční LC/MS/MS pro osm různých enzym-substrátových párů prokázalo velmi dobrou korelaci (R2=0,986). RapidFire/MS skracuje dobu analýzy na 6–10 s na vzorek oproti 2–4 minutám při LC/MS/MS, což znamená více než desetinásobné zvýšení propustnosti. V časově závislých studiích bylo dosaženo až 20násobného zrychlení analýzy.

Přínosy a praktické využití metody

RapidFire/MS umožňuje snadnou integraci do existujících laboratorních workflow a nabízí robustní alternativu pro vysokopropustné ADME screeningy. Metoda poskytuje spolehlivá data o inhibici CYP izoenzymů s výrazným časovým i ekonomickým přínosem.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozvoj vysokopropustných hmotnostních technik spojených s plnou automatizací inkubace a vzorkového podávání. Rozšíření aplikace na další metabolické dráhy a integrace s pokročilými datovými analýzami zvýší efektivitu preklinického výzkumu.

Závěr

Systém Agilent RapidFire/MS prokázal vysokou přesnost a významné časové úspory při hodnocení inhibice cytochromů P450 a představuje robustní alternativu k tradičním LC/MS/MS metodám.

Reference

1. Perloff E., et al. Validation of cytochrome P450 time-dependent inhibition assays: a two-time point IC50 shift approach facilitates kinact assay design. Xenobiotica, 2011, 39(2):99-112.
2. Perloff E., et al. Comparison of RapidFire Ultra High Throughput LC/MS/MS with Traditional LC/MS/MS for Cytochrome P450 Inhibition Testing. Abstract #106, 11th European ISSX Meeting, 2009.
3. Miller V., et al. Evaluation of High Throughput Screening Methods for Time-Dependent Inhibition of CYP3A4 Utilizing RapidFire LC/MS/MS Technology. 11th European ISSX Meeting, 2009.