Accurate quantification of oleanolic acid and ursolic acid in traditional chinese medicine

Význam tématu

Tradiční čínská medicína obsahuje složité směsi přírodních látek, jejichž kvalita musí být přesně kontrolována. Obvyklé jedno­dimenzionální HPLC metody narážejí na problém koeluce cílových sloučenin s interferencemi z vedlejších průvodních látek. To omezuje spolehlivou kvantifikaci biologicky významných triterpenů, jako jsou kyselina oleanolová a kyselina ursolová. Orthogonální rozdělení pomocí 2D-LC umožňuje překonat tato omezení.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo vyvinout a ukázat robustní postup vysokorozlišujícího sběru vzorku v 2D-LC pro kvantifikaci kyseliny oleanolové a ursolové v extraktu Pterocephali Herbra. Metoda měla umožnit separaci cílových analytů od koelujících interferencí během jediného analytického běhu.

Použitá metodika a instrumentace

Pro orthogonální separaci byla použita dvojice kolonek Agilent InfinityLab Poroshell 120:

• První dimenze – Poroshell 120 Phenyl-Hexyl, 2,1 × 100 mm, 1,9 µm, fáze A: 10 mM octan amonný ve vodě, fáze B: methanol, gradient 75–100 % B, průtok 0,2 mL/min
• Druhá dimenze – Poroshell 120 EC-C18, 3,0 × 50 mm, 2,7 µm, fáze A: 0,05 % kyseliny fosforečné ve vodě, fáze B: acetonitril, gradient 50–90 % B, průtok 2 mL/min

Pro vysokorozlišující sběr vzorku byl nakonfigurován systém se 12 odběrovými smyčkami a dvěma typy ventilů. Metoda využívá osm časově řízených řezů pokrývajících celý vrchol zájmových analytů. Instrumentaci tvořily:

• Dva vysokotlaké pumpy Agilent 1290 Infinity II
• Multisampler s chlazenou vaničkou
• Dva MCT moduly a dva DAD detektory (10 mm a 60 mm buňky)
• Ventilový řadič s duo ventilem a dva ventily pro více řezů

Hlavní výsledky a diskuse

Jedno­dimenzionální metoda neposkytla dostatečné rozlišení kvůli složitosti vzorku. 2D-LC selektivně oddělila oleanolovou a ursolovou kyselinu od koelujících šumů. Osm řezů pokrylo celý profil analyzovaných píků. Kalibrační křivky pro oba analyty vykázaly lineární regresi s R2 > 0,999 v rozmezích 57,5–1150 µg/mL pro oleanolovou kyselinu a 50–1000 µg/mL pro ursolovou kyselinu. Opakovatelnost metody byla ověřena šesti analýzami standardů, RSD 0,8 % pro oleanolovou kyselinu a 1,3 % pro ursolovou kyselinu. Vzorky Pterocephali Herbra obsahovaly průměrně 95,6 µg/mL oleanolové kyseliny a 258,9 µg/mL ursolové kyseliny.

Přínosy a praktické využití metody

• Spolehlivá kvantifikace cílových triterpenů v komplexních extraktech
• Úspora času díky integraci dvou separačních kroků v jedné analýze
• Využití komerčně dostupných superficially porous kolonek s nízkým tlakovým spádem
• Možnost adaptace postupu pro další přírodní a farmaceutické matrice

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření postupů vysokorozlišujícího 2D-LC o přímé spojení s hmotnostní spektrometrií pro zlepšení selektivity a citlivosti. Dalším směrem je automatizace plánování řezů podle reálných chromatografických dat a miniaturizace pro zvýšení průtokové kapacity laboratoří.

Závěr

Vyvinutý postup vysokorozlišujícího sběru vzorku v 2D-LC prokázal svou schopnost přesně a reprodukovatelně kvantifikovat oleanolovou a ursolovou kyselinu v náročných maticích tradičních čínských medicín. Metoda nabízí robustní řešení pro rutinní kontrolu kvality.

Reference

• Stephan S. High-Resolution Sampling 2D-LC with the Agilent 1290 Infinity II 2D-LC Solution. Agilent Technologies Technical Overview, 2016, publikace 5991-7637EN.