Analysis of Free Drug Content in Antibody-Drug Conjugate Using 2D-LC/Q-TOF

Význam tématu

Antibody-drug conjugáty (ADC) představují moderní třídu cílených protinádorových bioléčiv, která kombinují vysokou specifitu monoklonálního protilátkového nosiče s potentní cytotoxickou malou molekulou. Měření obsahu volné cytotoxické složky (free drug) je klíčovou kvalitou ADC, neboť nepřipojený lék může snížit účinnost a zvýšit toxicitu přípravku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem uvedené application note je demonstrovat využití dvoudimenzionální kapalné chromatografie spojené s kvartérním TOF hmotnostním spektrometrem (2D-LC/Q-TOF) k detekci a kvantifikaci volného léku v ADC vzorku. Metoda kombinuje velikostní exclusi (SEC) a reverzní fází (RPLC) v režimu heart-cutting, čímž umožňuje automatickou online separaci proteinové i malé molekuly bez manuální precipitace.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika:

• První dimenze: SEC na Agilent AdvanceBio SEC kolóně za isokratických podmínek s 40 % acetonitrilu v 100 mM amonium acetátu (pH 7,0).
• Režim heart-cutting: tři průběžné rezervoáry (40 µL) automaticky přenášejí vybrané frakce do druhé dimenze.
• Druhá dimenze: RPLC na Agilent Poroshell EC-C18 (3,0 × 50 mm, 1,9 µm) s gradientem formamidové vody a acetonitrilu.
• Detekce: UV/VIS a Q-TOF MS v pozitivním ionizačním režimu, m/z 100–1 700.

Instrumentace:

• Agilent 1290 Infinity II Bio 2D-LC systém (dvě vysokorychlostní pumpy, ventilové jednotky pro heart-cutting, termostat vzorkovače a kolónový termostat).
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet Stream ESI.
• MassHunter Acquisition a Qualitative Analysis software verze 11.0.

Hlavní výsledky a diskuse

SEC v první dimenzi efektivně oddělila velké makromolekuly ADC od nízkomolekulárních látek. Optimalizace organického modifieru (40 % acetonitrilu) zaručila vyrovnaný eluce pro volný lék i ADC bez poškození kolóny. Tři kontinuální výřezy (heart-cutting) obsahující volný lék byly online navázány na RPLC, kde se separovaly dva analyty – DM1 a jeho linkerovaný derivát SMCC-DM1. Q-TOF MS ověřil identitu podle přesné hmotnosti ([M+H]+ 738,282 Da pro DM1; 1 072,399 Da pro SMCC-DM1) a detekoval typické addukty sodíku, draslíku i ztrátu vody.

Přínosy a praktické využití metody

• Automatizace procesu: eliminuje offline proteinovou precipitaci a zkracuje čas analýzy.
• Šetrnost k přístrojům: minimalizuje riziko kontaminace RP kolony proteiny.
• Citlivost a spolehlivost: přesná detekce volného léku a jeho derivátů v ADC matrici.

Budoucí trendy a možnosti využití

Integrace 2D-LC s vysokorozlišujícím MS se stává standardem pro charakterizaci komplexních biokonjugátů. Očekává se rozšíření o další kombinace separačních mechanizmů (iontová výměna, HILIC) a nasazení automatizovaných modulů pro vysokopropustné škálování QC laboratoří. Dále roste zájem o real-time monitoring stability ADC a o adaptaci metody pro multiplexní analýzu více konjugátů současně.

Závěr

Vyvinutá 2D-LC/Q-TOF metoda nabízí rychlou, spolehlivou a plně automatizovanou cestu pro zjištění volného cytotoxického léku v ADC. Kombinací SEC pro separaci proteinové frakce a RPLC pro rozlišení malých molekul zajišťuje vysokou účinnost, šetrnost k analytickému vybavení a přesnou identifikaci pomocí MS.

Reference

• Li Y.; et al. Limiting Degradation of Reactive Antibody Drug Conjugate Intermediates in HPLC Method Development. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis 2014, 92, 114–118.
• Hurwitz E.; et al. The Covalent Binding of Daunomycin and Adriamycin to Antibodies With Retention of Both Drug And Antibody Activities. Cancer Research 1975, 35, 1175–1181.
• Chari R. V.; et al. Enhancement of the Selectivity and Antitumor Efficacy of a CC-1065 Analogue Through Immunoconjugate Formation. Cancer Research 1995, 55, 4079–4084.
• Wong D. Characterization of Antibody-Drug Conjugates Using 2D-LC and Native MS. Agilent application note 2021, 5994-4328EN.
• Stoll D. R. Recent Advances in 2D-LC for Bioanalysis. Bioanalysis 2015, 7(24), 3125–3142.
• Singh R.; et al. A New Triglycyl Peptide Linker for Antibody–Drug Conjugates with Improved Targeted Killing of Cancer Cells. Molecular Cancer Therapeutics 2016, 15(6), 1311–1320.