A Discovery Proteomics Workflow for the Elucidation of Prostate Cancer Biomarkers

Význam tématu

Strukturální a kvantitativní analýza proteomu nádorových buněk prostaty je klíčová pro identifikaci nových biomarkerů a pochopení mechanismů tumorového růstu pod hypoxickými podmínkami.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat proteomy androgen-senzitivních a androgen-indepentních prostatických buněčných linií pod normoxickými a hypoxickými (DMOG) podmínkami ve dvou časových bodech (8 a 24 hodin) a identifikovat potenciální proteinové biomarkery.

Použitá metodika a instrumentace

Buňky LNCaP, LNCaP-abl a LNCaP-abl-Hof byly kultivovány ve standardních podmínkách a vystaveny DMOG pro simulaci hypoxie. Proteinové lyzáty byly zpracovány metodou FASP, redukovány DTT, alkylovány IAA a digesci prováděli enzymy Lys-C a trypsin. Peptidy byly očištěny C18 ZipTip a analyzovány nano LC-MS/MS na systému Agilent 6550 Q-TOF s HPLC-Chip Cube.
Seznam klíčové instrumentace:

• Agilent 6550 Q-TOF mass spectrometer
• Agilent Nano LC pump (G2226A) a Capillary pump (G1376A)
• Agilent Polaris-HR-3C18 150 mm×75 μm Chip kolona
• Agilent HPLC-Chip Cube (G4240A)
• Software: MassHunter, Spectrum Mill, Mass Profiler Professional, Pathway Architect

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza dat ukázala identifikaci 1225 proteinových entit po 8 hodinách a 1324 po 24 hodinách, přičemž 1080 bylo společných. ANOVA a PCA rozlišily androgen-senzitivní a androgen-indepentní linie jasněji než hypoxickou stimulaci. Volcano grafy ukázaly výraznější změny po 8 hodinách. Mapování na KEGG odhalilo narušení oxidační fosforylace, což koresponduje s buněčnou adaptací na nedostatek kyslíku.

Přínosy a praktické využití metody

Demonstrovaný přístup prokazuje schopnost neoznačené LC-MS/MS proteomiky v odhalování rozdílů v expresi proteinů v závislosti na buněčném stavu a prostředí, s využitím standardizovaných QC vzorků pro zajištění opakovatelnosti.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další fáze zahrnuje cílenou MRM analýzu na Agilent 6495 QQQ s návrhem metodiky ve Skyline. Integrace kvantitativních dat a bioinformatické vizualizace umožní validaci a rozvoj biomarkerů pro klinické aplikace a multiplexní screening.

Závěr

Popsaný pracovní postup propojuje objevnou a cílenou proteomiku pro systematické zkoumání hypoxicky modulovaných proteinových změn v prostatických buňkách a poskytuje platformu pro vývoj nových biomarkerů.

Reference

• Fraga A. et al. Clin. Genitourin Cancer 13, 295–301 (2015).
• Harrison L., Blackwell K. Oncologist 9 Suppl 5, 31–40 (2004).
• Yin L., Hu Q., Hartmann R.W. Int. J. Mol. Sci. 14, 13958–13978 (2013).
• Wisniewski J.R. et al. Nature Methods 6(5), 359–362 (2009).
• Allison K.E. et al. Immunology (2017).
• Sontakke P. et al. PLoS ONE 11(4), e0153226 (2016).