High-throughput PROTAC compound screening workflow for targeted protein degradation on an Orbitrap Astral mass spectrometer with accurate label-free quantitation

Význam tématu

Cílená degradace proteinů (TPD) představuje pokročilou strategii v objevování léčiv, kdy PROTAC molekuly zprostředkovávají degradaci cílových bílkovin prostřednictvím ubiquitin-proteasomového systému. Pro úspěšný vývoj těchto látek je klíčové rychlé, přesné a vysoce propustné kvantitativní stanovení degradační účinnosti a možných off-target efektů.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo navrhnout a ověřit robustní workflow pro vysokopropustný screening PROTAC sloučenin na Orbitrap Astral hmotnostním spektrometru s label-free kvantifikací. Studie porovnala čtyři úrovně propustnosti (24, 60, 180 a 300 vzorků za den) a zhodnotila přesnost, pokrytí proteomu a reprodukovatelnost.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky VCaP buněk ošetřených různými koncentracemi PROTAC degradéru ARCC-4 byly připraveny automatizovanou platformou AccelerOme s EasyPep lyzačním pufrem a kvantifikovány BCA testem. Peptidy byly separovány ve Vanquish Neo UHPLC systému:

• 50 cm EASY-Spray PepMap Neo kolona (24 SPD)
• 15 cm EASY-Spray PepMap kolona (60 a 180 SPD)
• 5 cm IonOpticks Aurora UHPLC kolona (300 SPD)

Eluce probíhala v režimu trap-and-elute s nano a kapilárním tokem. Analýza se uskutečnila na Orbitrap Astral MS použitím široce-úzce okenné DIA. Data byla zpracována v softwaru Spectronaut, DIA-NN a Proteome Discoverer s algoritmem CHIMERYS (MSAID). Downstream analýzy a vizualizace proběhly v Pythonu.

Hlavní výsledky a diskuse

Workflow pro LFQ-DIA na Orbitrap Astral umožnilo:

• Identifikaci ~10 400 proteinových skupin při 24 SPD a ~10 000 při 60 SPD
• Identifikaci ~8 500 proteinových skupin při 180 SPD a ~8 000 při 300 SPD
• Vysokou kvantitační přesnost s mediánem poměrů blízko teoretické hodnoty a CV ~10 %
• Konzistentní, koncentracemi závislou degradaci androgenového receptoru (AR) s podobnými DC50 hodnotami napříč všemi throughput úrovněmi

Volcano analýzy potvrdily AR jako hlavní degradovaný protein a ukázaly spolehlivé on-target/off-target rozlišení ve všech režimech.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené workflow kombinuje vysokou rychlost a hloubkové pokrytí proteomu, což zajišťuje:

• Rychlou identifikaci vedoucích kandidátů v TPD screeningových fázích
• Spolehlivou kvantifikaci a validaci degradační účinnosti
• Možnost přímého přechodu mezi vysokopropustným screeningem a detailními analýzami

Budoucí trendy a možnosti využití

Použití ultra-rychlých gradientů a DIA metodik lze rozšířit o:

• Integraci strojového učení pro automatické vyhodnocování degradomických dat
• Adaptaci na další třídy degraderů a cílových bílkovin
• Implementaci do klinického výzkumu a QA/QC procesů v průmyslové výrobě léčiv

Závěr

Orbitrap Astral MS doplněný o LFQ-DIA workflow pro 24–300 SPD nabízí unikátní kombinaci propustnosti, proteomického pokrytí a kvantitační přesnosti. Tato platforma významně urychlí screening a validaci PROTAC molekul a poskytne hluboké biologické vhledy potřebné pro cílenou degradaci proteinů v procesu vývoje nových léčiv.