The Agilent Nanodapter for Discovery Proteomics Using Nanoflow LC/MS

Význam tématu

Nanoflow LC/MS se stalo standardní technikou pro objevnou proteomiku, protože poskytuje špičkovou citlivost při analýze omezených vzorků. Možnost detekovat větší počet peptidů a proteinů z malého množství materiálu je klíčová pro identifikaci biomarkerů nebo studium dynamiky proteomu.

Cíle a přehled studie

Cílem představené technické studie bylo demonstrovat flexibilitu a výkon Agilent Infinity UHPLC Nanodapteru při nanoflow separacích v kombinaci s masovým spektrometrem Agilent 6550 iFunnel Q-TOF. Autoři porovnali dva režimy nanoflow aplikace (přímá injekce a trapping) pro analýzu lidského K562 buněčného extraktu a hodnotili chromatografické parametry, počet identifikovaných peptidů a proteinů a reprodukovatelnost.

Použitá metodika a nastavení

Pro analýzu byl použit následující pracovní postup:

• Režim přímé injekce i trapping pro efektivní nakládání na kolonu
• Guard kolona 75 µm × 2 cm a analytická kolona 75 µm × 25 cm s C18 stacionární fází při 60 °C
• Mobilní fáze: voda a acetonitril s 0,1 % kyseliny formové
• Gradient 3–70 % B v průběhu 120 minut při toku ~320 nL/min
• Data-dependent acquisition (DDA) s rychlostí 8 spekter/s v MS a 3 spektra/s pro MS/MS

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II binary pump s UHPLC Nanodapterem
• Agilent G1992A nanoESI zdroj
• Agilent 6550 iFunnel Q-TOF masový spektrometr

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatografické oddělení vykázalo velmi úzké píky (medián šířky 13 s) a vysokou opakovatelnost v tripletech. Celkem bylo identifikováno 20 735 unikátních peptidů a 2 833 proteinů, přičemž průměrné hodnoty byly 16 025 peptidů a 2 437 proteinů na analýzu. Data ukazují výjimečnou citlivost i reprodukovatelnost nanoflow LC/MS platformy.

Přínosy a praktické využití metody

Díky rychlé přestavbě mezi standardním a nanoflow režimem (<30 minut) a možnosti volby mezi přímou injekcí a trappingem získávají laboratoře velmi univerzální nástroj. Zvýšená citlivost usnadňuje analýzu vzácných vzorků a komplexních biologických matric.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikací v oblasti single-cell proteomiky, hloubkové charakterizace posttranslačních modifikací a integrace s datově nezávislými akvizicemi (DIA). Dále se předpokládá automatizace přípravy vzorků a vysokokapacitní screening pro farmaceutický výzkum.

Závěr

Agilent Infinity UHPLC Nanodapter v kombinaci s 1290 Infinity pumpou, nanoESI zdrojem a 6550 iFunnel Q-TOF nabízí uživatelům jediné UHPLC řešení pro standardní i nanoflow separace s vynikající citlivostí, flexibilitou a robustností.

Reference

• Jet Stream Proteomics for Sensitive and Robust Standard Flow LC/MS, Agilent Technologies, publication number 5991-5687EN
• Maximize Nanoflow LC/MS Performance Using the Flexible, Easy-to-configure Agilent nanoESI Source, Agilent Technologies, publication number 5991-1041EN