Fast and Sensitive Pharmacokinetic Assessment Using an Agilent LC/MS Triple Quadrupole System

Význam tématu

Farmakokinetické studie poskytují klíčové informace o vstřebávání, distribuci, metabolismu a vylučování léčivých látek. Rychlé a citlivé metody LC/MS/MS hrají zásadní roli v raných fázích vývoje léčiv, kdy je třeba provést simultánní analýzu více látek (cassette dosing) s minimálním objemem vzorku a maximální výtěžností dat. Efektivní separace a detekce desítek sloučenin ve velmi nízkých koncentracích umožňuje urychlit optimalizaci kandidátních sloučenin a snížit počet experimentálních zvířat.

Cíle a přehled studie

Cílem uvedené studie bylo vyvinout universální LC/MS/MS metodu pro simultánní kvantifikaci 26 antiepileptik (AED) a ověřit její aplikovatelnost na farmakokinetická hodnocení tří vybraných látek (gabapentin, tiagabin, lamotrigin) v plazmě potkanů po intravenózní kasetové dávce. Studie zahrnovala optimalizaci chromatografických podmínek, validaci bioanalytické metody a demonstraci aplikace v reálné PK studii.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC systém s binárním čerpadlem, multisamplerem s multiwash funkcí a diodovým detektorem
• Agilent ZORBAX Eclipse Plus Phenyl-Hexyl kolona (2,1 × 50 mm, 1,8 µm, 50 °C)
• Agilent 6495 Triple Quadrupole MS s iFunnel technologií a ESI-AJS zdrojem

Použitá metodika

Vzorky plazmy (50 µL) byly připraveny srážením proteinů použitím 200 µL acetonitrilu obsahujícího vnitřní standard. Supernatant (1 µL) se analyzoval gradientní elucí s mobilními fázemi obsahujícími 10 mM amonného acetátu a 0,1 % kyseliny mravenčí ve vodě nebo methanolu. Rozdělení všech 26 AED bylo dosaženo do 6 minut. Detekce probíhala v dynamickém režimu múltiple reaction monitoring (DMRM) optimalizovaném pro pozitivní i negativní ionizaci. Kalibrace proběhla na 18 bodech, linearita byla hodnocena modelem lineárního regresního typu s váhováním 1/y.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chromatografická separace 26 AED s vynikajícími tvary píků a reprodukovatelností v rámci 6 minut.
• Limit detekce (LOD) v rozmezí 0,15–4,9 nM, kvantifikační LOQ 0,31–9,8 nM.
• Lineární rozsahy 0,31–20 000 nM se korelačními koeficienty R2 >0,99.
• Přesnost a precizita (RSD <5 % pro všechny koncentrace nad LOQ) v souladu s mezinárodními požadavky.
• Multiwash autosampler zajistil minimální carryover (<0,1 %) i po analýze nejvyšší kalibrační úrovně.
• Farmakokinetická aplikace pro gabapentin, tiagabin a lamotrigin v kasetové IV studii v potkanech prokázala konzistentní parametry (AUC, clearance, objem distribuce, poločas rozpadu) a detekci koncentrací po dobu až 48 hodin.

Přínosy a praktické využití metody

• Možnost rychlého screeningu desítek sloučenin v jednom běhu.
• Nízký objem vzorku (50 µL) a jednoduchá příprava vzorků proteinovou precipitací.
• Vysoká citlivost umožňující sledování subnanomolárních koncentrací.
• Minimalizace meziprofilného znečištění díky multiwash injektoru.
• Úspora času a biologických zdrojů pro farmakokinetická hodnocení.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření panelu analyzovaných sloučenin o metabolity či nové lékové kandidáty.
• Implementace vysoce výkonných hmotnostních analyzátorů (HRMS) pro necekované složky a metabolomické studie.
• Další automatizace vzorkovacího procesu a miniaturizace přípravy vzorků pro vysokoprůchodové laboratoře.
• Integrace PK/PD modelování a in vitro–in vivo extrapolace pro přesnější predikci chování léčiva.
• Využití metody v klinickém terapeutickém sledování (TDM) a v nastavení QC procesů ve farmaceutickém průmyslu.

Závěr

Vyvinutá LC/MS/MS metoda na platformě Agilent 1290 Infinity II LC a 6495 Triple Quadrupole umožňuje selektivní, citlivé a vysokoprůchodové stanovení 26 antiepileptik v krátkém čase. Validace ukázala vynikající parametry přesnosti, precizity, linearity a minimálního carryover. Aplikace v kasetové farmakokinetické studii v potkanech potvrdila robustnost metody při analýze nízkých koncentrací v dlouhém časovém rozpětí.

Reference

1. Hughes JP, Rees S, Kalindjian SB, Philpott KL. Principles of early drug discovery. British Journal of Pharmacology. 2011;162(6):1239-1249.
2. Nagilla R, Fu D, Chiu SH, Mayor JA, Yu M, Houser SR. Cassette dosing for pharmacokinetic screening in drug discovery: comparison of clearance, volume of distribution, half-life, mean residence time, and oral bioavailability obtained by cassette and discrete dosing in rats. Journal of Pharmaceutical Sciences. 2011;100(9):3862-3874.
3. Korfmacher WA, Barkey NM, Messersmith RT, Smith EJ. Cassette-accelerated rapid rat screen: a systematic procedure for dosing and liquid chromatography/atmospheric pressure ionization tandem mass spectrometric analysis of new chemical entities as part of new drug discovery. Rapid Communications in Mass Spectrometry. 2001;15(5):335-340.