Profiling of Endogenous Metabolites Using Time-of-Flight LC/MS with Ion‑Pair Reverse Phase Chromatography

Význam tématu

Profilování endogenních metabolitů je zásadní pro porozumění biochemickým procesům v buňkách a pro identifikaci biomarkerů chorobných stavů
Monitorování metabolických změn je klíčové ve farmacii, QA/QC a průmyslové analytice
Iontové párování v reverzní chromatografii spojené s vysokorozlišeným TOF MS umožňuje široké pokrytí polárních i aniontových molekul

Cíle a přehled studie

Cílem bylo vyvinout robustní a reprodukovatelnou IP-RP LC/TOF MS metodu pro simultánní analýzu různých tříd endogenních metabolitů
Optimalizace pH mobilní fáze a gradientu pro separaci biologicky významných izomerů (citrát/izocitrát, D-Glc-6-P/α-D-Glc-1-P, leucin/isoleucin, maleát/fumarát)
Testováno na 38 standardech pokrývajících aminokyseliny, organické kyseliny, cukry, nukleosidy, nukleotidy, koenzymy A apod.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity LC, kolona ZORBAX RRHD Extend 80 Å C18 (2.1×150 mm, 1.8 μm), ochranná C8 kolona
• Mobilní fáze: A) voda/methanol (97/3) s 5 mM tributylaminu, pH upraveno octovou kyselinou; B) čistý methanol s 5 mM tributylaminu
• Gradient: 0–99 % organické fáze (B) v 22 minutách, post time 5 minut
• Teplota kolony 40 °C, autosampler 4 °C, objem injekce 5 μL, průtok 0.25 mL/min
• MS detekce: Agilent 6230 TOF MS s dvojitou ESI v negativním módu
• Parametry MS: kapilární napětí 3500 V; suchý plyn 13 L/min při 250 °C; nebulizér 35 psi; rozsah 60–1600 m/z; akviziční rychlost 1.5 spektr /s
• Kontinuální referenční kalibrace hmotností 62.0327 a 983.0347 m/z

Hlavní výsledky a diskuse

• Detekce 38 endogenních metabolitů se širokým časovým rozložením a hmotnostní přesností
• Separace polárních, aniontových i hydrofobních látek v jediném 22min běhu
• Úspěšné rozlišení čtyř párů biologicky významných izomerů díky optimalizaci pH 5.8 a nelineárnímu gradientu
• Změny pH mobilní fáze ovlivňují retenci, selektivitu a signální odezvu různých tříd metabolitů
• Snížení koncentrace tributylaminu o polovinu neovlivnilo citlivost, zvýšilo robustnost a čistotu zdroje

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a reprodukovatelný workflow pro komplexní metabolomické analýzy
• Vysoká přesnost hmotnosti TOF MS podporuje spolehlivou identifikaci a kvantifikaci
• Vhodné pro biomarkerové studie, farmakokinetiku, QA/QC klinických a průmyslových vzorků

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s pokročilými statistickými a AI nástroji pro hlubokou analýzu dat
• Rozšíření na další iontově párovací činidla pro specifické skupiny látek
• Automatizace a nasazení v rutinních klinických laboratořích
• Propojení s iontovou mobilitou (IM-MS) pro lepší strukturální charakterizaci

Závěr

Vyvinutá IP-RP LC/TOF MS metoda přináší robustní, rychlý a široce použitelný přístup k profilování endogenních metabolitů
Optimalizace pH 5.8 a použití tributylaminu zajišťují efektivní separaci a konzistentní citlivost
Metoda je vhodná pro výzkumné i průmyslové aplikace v oblasti metabolomiky

Reference

1. Dai Y.; et al. Metabolomics Batch Data Analysis Workflow to Characterize Differential Metabolites in Bacteria, Agilent Technologies Application Note, 2015.
2. Jenkins S.; et al. Compound Identification, Profiling and Pathway Analysis of the Yeast Metabolome in Mass Profiler Professional, Agilent Technologies Application Note, 2013.
3. Zhang T.; et al. Anal. Chem. 2012, 84, 1994–2001.
4. Lu W.; et al. Anal. Chem. 2010, 82, 3212–3221.