Discovery Metabolomics LC/MS Methods Optimized for Polar Metabolites

Význam tématu

Metabolomika hraje klíčovou roli v porozumění biochemickým procesům v buňkách a organismech. Polarita mnoha endogenních metabolitů představuje výzvu pro chromatografickou separaci a spolehlivou identifikaci, zvláště u izomerů a sloučenin s podobnou hmotností. Přesné stanovení retence, vysoké rozlišení a citlivá detekce jsou proto zásadní pro nekonvenční objevování metabolitů a jejich kvantitativní sledování v široké škále vzorků.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat dvě vzájemně se doplňující hydrofobně-interakční chromatografické (HILIC) metody při vysokém pH a nízkém pH pro LC/Q-TOF hmotnostní spektrometr. Metody mají poskytovat široké pokrytí kategorií polárních metabolitů (vitaminy, aminokyseliny, cukry, fosfáty, organické kyseliny, nukleotidy a deriváty koenzymu A) a zároveň umožnit separaci biologicky relevantních izomerů. Robustnost přístupu byla ověřena analýzou kvasinkových extraktů během 25hodinového běhu.

Použitá metodika a instrumentace

Chromatografie:

• Kolona: Agilent InfinityLab Poroshell 120 HILIC-Z, 2,1×150 mm, 2,7 µm, PEEK-lined
• Mobilní fáze vysoké pH: 10 mM amonný acetát pH 9 s přídavkem deaktivátoru kovů (2,5 µM)
• Mobilní fáze nízké pH: 10 mM amonný formiát pH ~2,8 s 0,1 % kyseliny mravenčí
• Gradienty optimalizované pro pozitivní (vitaminy, aminokyseliny, polyaminy) a negativní (cukry, fosfáty, organické kyseliny, nukleotidy, CoA) ionizační režim

Detekce a ionizace:

• Agilent 1290 Infinity II LC System s vysokorychlostním pumpovacím modulem, multisamplerem a multikolonovým termostatem
• Agilent 6545 LC/Q-TOF s AJS zdrojem: optimalizované teploty sušícího a plášťového plynu, tlaky a napětí
• Referenční hmotnostní kalibrace kontinuální infuzí

Vzorky:

• 20 párů standardních izomerů a 45 reprezentativních metabolitů pro vývoj a ověření metod
• Kvasinkové extrakty pro posouzení reprodukovatelnosti a stability během dlouhodobého běhu

Hlavní výsledky a diskuse

Obě metody dosáhly baseline separace 15 párů biologicky významných izomerů (např. L-Leucin/L-Isoleucin, 2-PG/3-PG, IPP/DMAPP, G-1-P/G-6-P, ADP izomery). Mobilní fáze při nízkém pH zlepšila tvar vrcholu a citlivost u aminokyselin, vitaminů a polyaminů, zatímco vysoké pH podporovalo detekci organických kyselin, cukrů a koenzymů. Optimalizace AJS parametrů (sušící a plášťový plyn) vedla k nárůstu signálu pro většinu analyzovaných tříd metabolitů. Robustnost metody potvrdily opakované injekce kvasinkových extraktů: relativní rozptyl retence <1,1 % a intenzity signálu <15 %, průměrná absolutní chyba hmotnostního určení ≤1,6 ppm, RSD hmotnostní chyby ≤1,2 ppm během 50 běhů (25 h).

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizovaný HILIC LC/Q-TOF přístup umožňuje:

• Komplexní profilování širokého spektra polárních metabolitů
• Rozlišení strukturních izomerů a blízkoizobarických sloučenin
• Spolehlivou repoduikovatelnost retence a kvantifikace v průběhu dlouhodobých analýz
• Vysokou přesnost hmotnostního určení pro podporu důvěryhodné anotace metabolitů

Budoucí trendy a možnosti využití

Metodu lze rozšířit a vylepšit implementací rychlého přepínání polarity, integrací MS/MS databází pro potvrzení struktur, miniaturizací a automatizací přípravy vzorků, multiplexními analýzami a aplikací ve sledování metabolických drah (fluxomika) či klinické metabolomice.

Závěr

Vyvinuté vysoké a nízké pH HILIC metody kombinované s přesnou LC/Q-TOF detekcí poskytují robustní, citlivý a vysoce selektivní nástroj pro komplexní analýzu polárních metabolitů, včetně separace izomerů a dlouhodobé stability měření.

Reference

1. Schrimpe-Rutledge A. C. a kol., J. Am. Soc. Mass Spectrom. 2015, 27(12):1897–1905.
2. Hsiao J. J. a kol., Anal. Chem. 2018, 90(15):9457–9464.
3. Hsiao J. J. a kol., LCGC Special Issues 2018, 36(6):30–35.