Quantitative Determination of a Panel of Endogenous Steroids in Human Serum by LC/MS/MS - Using an Agilent Supported Liquid Extraction (SLE) Chem Elut S Plate

Význam tématu

Endogenní steroidy v lidské krvi hrají zásadní roli jako biomarkery při diagnostice onemocnění a sledování hormonálních terapií. Kvantifikace nízkých koncentrací steroidů vyžaduje citlivé, spolehlivé a reprodukovatelné analytické postupy. Vysokopropustné a automatizovatelné metody s účinným odstraněním interferencí z matrice usnadňují rutinní provoz klinických i výzkumných laboratoří.

Cíle a přehled studie

Cílem této studie bylo vyvinout a ověřit kvantitativní LC/MS/MS metodu pro 15 endogenních steroidů v lidském séru s využitím Agilent Supported Liquid Extraction (SLE) Chem Elut S 2mL 96-jamkové desky. Hlavní parametry zahrnovaly rozsahy kalibrace 5–10 000 pg/mL (některé analyty 10–10 000 nebo 20–10 000 pg/mL), LOQ 5–20 pg/mL, přesnost 80–120 % a opakovatelnost RSD < 15 %.

Použitá metodika

Pro extrakci sér vyhověly následující kroky:

• Aliquotace 200 µL séra do sběrné desky, přídavek interního standardu.
• Přenos na SLE desku Chem Elut S (200 mg) s gravitačním naléváním a třemi elucemi 400 µL směsi MTBE/EtOAc (1:1).
• Sušení eluátu dusíkem při 40 °C, rekonstituce v 100 µL 1:1 MeOH/voda.
• Vysokopropustné zpracování v 96-jamkové formě, vhodné pro automatizaci.

Použitá instrumentace

• UHPLC: Agilent 1290 Infinity s kolonkou ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18 (100 × 2,1 mm, 1,8 µm).
• MS/MS: Agilent 6490 Triple Quadrupole s JetStream iFunnel ESI, režim dMRM.
• Mobilní fáze: A – 0,2 mM NH₄F ve vodě, B – 0,2 mM NH₄F v methanolu, průtok 0,4 mL/min, teplota kolony 40 °C.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosáhla LOQ 5 pg/mL pro většinu steroidů (estradiol a testosterone 10 pg/mL; progesteron, 17-hydroxypregnenolon a hydrokortizon 20 pg/mL). Kalibrační křivky vykázaly linearitu (R² > 0,99) s vážením 1/x². Třídenní ověření prokázalo přesnost 89–119 % a mezidení RSD 2–16 %. Srovnání SLE versus tradiční LLE ukázalo o 10–20 % vyšší průměrné zotížení analytů a nižší pracovní náročnost. Ve srovnání s diatomové SLE měly Chem Elut S desky lepší konzistenci šarží a výkonnější čištění od fosfolipidů (až o 99 % lepší deplece proti konkurentovi).

Přínosy a praktické využití metody

• Zkrácení doby přípravy až o 50 % díky eliminaci míchání a odstředění.
• Homogenní provoz desek SLE zajišťuje minimalizaci variability mezi vzorky i šaržemi.
• Vysoká selektivita a nízký LOQ umožňují sledování nízkých hladin steroidů v klinických studiích.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření panelů o steroidní metabolity a glukokortikoidy, integrace plné automatizace příprav vzorků a nasazení v toxikologii či personalizované medicíně. Vhodné je také zkoumat alternativní ionizační techniky a manažment dat pro podporu strojového učení.

Závěr

Navržená LC/MS/MS metoda s Agilent Chem Elut S podporovanou extrakcí poskytuje citlivou, přesnou a vysoce propustnou platformu pro stanovení endogenních steroidů v lidském séru. Díky vynikající reprodukovatelnosti a účinnému odstraňování interferencí je vhodná pro rutinní klinické i výzkumné aplikace.

Reference

1. Anari MR et al. Derivatization of Ethinylestradiol with Dansyl Chloride to Enhance Electrospray Ionization. Anal Chem. 2002;74:4136–4144.
2. Lee JS et al. Comparison of methods to measure low serum estradiol levels in postmenopausal women. J Clin Endocrinol Metab. 2006;91:3791–3797.
3. Kushnir MM et al. High-Sensitivity Tandem Mass Spectrometry Assay for Serum Estrone and Estradiol. Clin Chem. 2008;129:530–539.
4. Wang W, Cole RB. Enhanced Collision-Induced Decomposition Efficiency for Anionic Adducts in Negative Ion ESI. Anal Chem. 2009;81:8826–8838.
5. Hindle R. Improved Analysis of Trace Hormones in Drinking Water by LC/MS/MS using Agilent 6460. Agilent Application Note. 2013.