Preparation of Released N-Glycan Samples from Monoclonal Antibodies Using Agilent AdvanceBio Gly-X 2-AB Express for LC-Fluorescence Analysis

Význam tématu

Glykování bioterapeutických proteinů je klíčovým parametrem ovlivňujícím farmakokinetiku, farmakodynamiku i imunogenicitu léčivých protilátek. Nadměrné či odlišné vzory N-glykanů mohou změnit účinnost a bezpečnost produktu, proto je rychlá a spolehlivá analýza těchto sacharidových řetězců nezbytná pro vývoj i kontrolu jakosti.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem pokynu je popsat efektivní postup pro uvolnění, značení a čištění N-glykanů z monoklonálních protilátek pomocí kitu Agilent AdvanceBio Gly-X 2-AB Express. Protokol zkracuje čas přípravy vzorku z obvyklého dne až na dvě hodiny při zachování vysoké reprodukovatelnosti a kompatibility s historickými daty získanými značením 2-aminobenzamidem (2-AB).

Použitá metodika a instrumentace

Postup se skládá z následujících kroků:

• Denaturace proteinu: 3 minuty při 90 °C
• Deglykosylace: 5 minut při 50 °C s enzymem PNGase F (specifickým pro N-vázané glykany)
• Značení 2-AB: inkubace 60 minut při 65 °C přímo na HILIC pevném nosiči bez předchozího sušení
• Čištění: 15–20 minut při pokojové teplotě, odstranění přebytečného barviva a eluace značených glykosidů vodou

Analytická separace probíhá na LC-FLD soustavě Agilent 1290 Infinity II s kolonkou AdvanceBio Glycan Mapping (2,1 × 150 mm, 1,8 µm) při 40 °C, s mobilní fází A – 50 mM formiátu amonného (pH 4,5) a B – acetonitril. Detekce fluorescenčním detektorem (Ex 260 nm, Em 430 nm).

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II pumpa
• Agilent Infinity multisampler
• Agilent 1290 Infinity II multicolumn thermostat
• Agilent 1260 Infinity fluorescence detector
• Agilent MassHunter Acquisition a Qualitative Analysis software

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda byla ověřena na vzorcích N-glykanů z protilátek MabThera a Enbrel. Chromatogramy ukazují, že MabThera má jednodušší profil s převahou G0F a G1F, zatímco Enbrel obsahuje vyšší podíl sialylovaných forem. Reprodukovatelnost tří paralelních příprav MabThera dosáhla u hlavních forem %CV pod 1 % až 4 %, u nízce zastoupených glykosidů do 9 %. Srovnání s dřívější metodou ProZyme GlykoPrep 2-AB pro Enbrel prokázalo téměř identické relativní zastoupení glykosidů.

Přínosy a praktické využití metody

Krátký čas přípravy (do 2 hodin), absence sušení a vysoká reprodukovatelnost umožňují rychlou zpětnou vazbu v průběhu vývoje i rutinní QC. Kompatibilita se stávajícími daty ze značení 2-AB usnadňuje dlouhodobé sledování glykanového profilu.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vývoj štěpení a značení ještě rychlejšími enzymy a chemickými činidly
• Integrace plně automatizovaných pracovních stanic pro vysokou propustnost
• Návrh nových fluorescenčních či hybridních značení kombinujících zvýšenou citlivost pro LC-MS
• Využití strojového učení pro automatizovanou identifikaci a kvantifikaci glykosidů

Závěr

Agilent AdvanceBio Gly-X 2-AB Express umožňuje rychlou a robustní přípravu 2-AB značených N-glykanů za méně než dvě hodiny. Výsledná data jsou vysoce reprodukovatelná a slučitelná se staršími protokoly, což podporuje jejich nasazení v rutinní analytice bioterapeutik.

Reference

• Liu L. Antibody Glycosylation and its Impact on the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Monoclonal Antibodies and Fc-Fusion Proteins. J. Pharm. Sci. 2015, 104(6), 1866–1884.
• Reusch D., Tejada M. L. Fc Glycans of Therapeutic Antibodies as Critical Quality Attributes. Glycobiology 2015, 25(12), 1325–1334.
• Ruhaak L. R. et al. Glycan Labeling Strategies and Their Use in Identification and Quantification. Anal. Bioanal. Chem. 2010, 397(8), 3457–3481.
• Kimzey M. et al. Development of a 5-Minute Deglycosylation Method for High Throughput N-Glycan Analysis by Mass Spectrometry. ProZyme Technical Note, Bulletin 4001, Rev E.