Comparison of Common Fluorescent Labels for LC/MS Analysis of Released N-Linked Glycans

Význam tématu

Glykozylace bioterapeutických proteinů je klíčovým kvalitativním atributem ovlivňujícím jejich imunogenicitu, farmakokinetiku a farmakodynamiku. Pro analýzu N-glykanů uvolněných z monoklonálních protilátek a Fc-fúzních proteinů je nezbytné zvýšit jejich detekční citlivost pomocí fluorescenčních nebo hmotnostně spektrometrických značek. Výběr optimálního barviva ovlivňuje rychlost přípravy vzorku, kvalitu chromatografického dělení i intenzitu signálu ve fluorescenci a MS.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo porovnat výkon pěti běžných fluorescenčních značek (InstantPC, InstantAB, 2-AB, 2-AA a procainamid) při analýze N-glykanů uvolněných z bioterapeutik MabThera a Enbrel. Hodnoceny byly fluorescenční a MS odezva, retenční časy v HILIC-UHPLC, schopnost separace hlavních i stopových glykanů a rychlost a efektivita značení.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky glykanů uvolněné enzymem PNGase F z protilátek MabThera a Enbrel byly připraveny pomocí sady Agilent GlykoPrep. Labeling probíhal buď rychlou reakcí InstantDyes (InstantPC, InstantAB) nebo klasickou reduktivní aminační reakcí (2-AB, 2-AA, procainamid) s následným čištěním a úpravou objemu na 50 µl. Separace proběhla v módu HILIC-UHPLC na amidemodifikované kolonce (2,1×150 mm, 1,7 µm) za gradientu 25–38 % 50 mM amonium formiátu (pH 4,4) při flow 0,4 ml/min. Fluorescenční detekce byla nastavena na specifické Exc/Em vlnové délky pro každé barvivo. MS analýza byla prováděna na Q-TOF s ESI v pozitivním módu (kapilární napětí 2,8 kV, zdroj 120 °C, desolvační teplota 350 °C) skenem 400–2000 Da.

Hlavní výsledky a diskuse

InstantPC vykázalo nejvyšší intenzitu fluorescenčního i MS signálu, přibližně dvojnásobek oproti procainamidu a výrazně vyšší komfort detekce oproti 2-AB a 2-AA. Retenční pořadí glykanů bylo u všech barev podobné: 2-AB → 2-AA → InstantAB → InstantPC → procainamid. Pouze InstantPC a procainamid zajistily adekvátní rozlišení regionů Man5/G1[6]/G1[3] a A1F[6]/A1F[3], což vedlo k detekci stopových glykanů A1F včetně jejich izomerů. Korelace mezi relativními oblastmi piků ve fluorescenčním a MS záznamu byla nejpřesnější u InstantPC.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá chemie InstantPC výrazně zkracuje dobu přípravy vzorku (minuty vs hodiny až dny u klasických metod).
• Nejvyšší citlivost umožňuje detekci i velmi nízkých hladin glykanů, klíčové pro in-depth glykoprofilování bioterapeutik.
• Vysoká shoda mezi fluorescencí a MS signálem usnadňuje kvantitativní analýzu bez nutnosti složité kalibrace.
• Optimální chromatografické rozlišení zajišťuje spolehlivé oddělení hlavních i minoritních glykanů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další vývoj instantních značicích reagentů s ještě vyšší ionizační účinností a širším spektrem detekčních modulů. Integrace do plně automatizovaných vysokopropustných platforem a propojení s pokročilými datovými analýzami umožní rychlejší a přesnější glykoprofilování. Dále se otevírá prostor pro aplikace v personalizované medicíně, monitoringu stability proteinových léčiv a objevování glykanových biomarkerů v klinických vzorcích.

Závěr

Agilent InstantPC se ukázalo jako nejvhodnější značka pro rutinní i pokročilou analýzu N-glykanů díky své rychlosti, citlivosti a robustnímu výkonu ve fluorescenční i MS detekci. Umožňuje detekci nízkoodhadových glykanů, nabízí lepší rozlišení a přesnou kvantifikaci, což významně zrychluje a zkvalitňuje glykanovou charakterizaci bioterapeutik.

Reference

1. Liu L. Antibody glycosylation and its impact on the pharmacokinetics and pharmacodynamics of monoclonal antibodies and Fc-fusion proteins. J. Pharm. Sci. 2015;104(6):1866–1884.
2. Anumula KR. Advances in fluorescence derivatization methods for high-performance liquid chromatographic analysis of glycoprotein carbohydrates. Anal. Biochem. 2006;350(1):1–23.
3. Kimzey et al. A Streamlined Workflow for Characterization of Low-Abundance Glycans on Therapeutic Proteins. ProZyme poster, ASMS 2014.
4. Aich U. et al. State-of-the-art technologies for rapid and high-throughput sample preparation and analysis of N-glycans from antibodies. Electrophoresis 2016;37(11):1468–1488.
5. Kimzey et al. Development of an Instant Glycan Labeling Dye for High Throughput Analysis by Mass Spectrometry. ProZyme poster, ASMS 2015.
6. US Patent 8445292.