Quantitation of Gut Microbiota‑Derived Indole Metabolites by Ion Pairing dMRM LC/QQQ

Význam tématu

Role střevní mikrobioty ve zdraví a nemoci je předmětem intenzivního výzkumu. Indolové metabolity vznikající z tryptofanu prostřednictvím bakterií ovlivňují imunitní a metabolické dráhy hostitele, podporují integritu střevní bariéry a modulují zánětlivé odpovědi.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem je rozšíření stávající iontově párované reverzní fází (IP-RP) dynamické MRM (dMRM) LC/QQQ metody o panel indolových metabolitů spojených s aktivitami ligandů AhR, PXR a GPCR. Studie popisuje optimalizaci separace, detekce a kvantifikace těchto sloučenin v biologických vzorcích.

Použitá metodika a instrumentace

• Příprava standardních směsí: 17 indolových metabolitů ve 3 miskách, každý na 100 µg/mL v methanolu.
• Optimalizace: Krok 1 – zjištění retenčního času ve scan režimu; Krok 2 – optimalizace MRM přechodů, fragmentoru a kolizní energie pomocí MassHunter Optimizeru; Krok 3 – integrace parametrů zpět do původní metabolomické dMRM metody s časovým plánováním přechodů.
• Instrumentace: Agilent 1290 Infinity II LC, Agilent 6470A triple quadrupole LC/MS.

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda dosahuje výborného rozlišení přidaných indolových metabolitů na IP-RP kolóně. Kalibrační křivky vykazují linearitu R2 > 0,999 napříč třemi řády koncentrace (> 100 nM až desítky µg/mL). Sériové opakování ukazuje dobrou reprodukovatelnost (RSD < 5 %) jak v retenční době, tak v odezvě špičky.

Přínosy a praktické využití metody

Robustní rozšíření existující metabolomické dMRM metody umožňuje současnou analýzu více než 200 metabolitů, včetně klíčových indolových sloučenin. Metoda poskytuje citlivou, rychlou a vysoce reprodukovatelnou kvantifikaci vhodnou pro studie mikrobioty a hostitel–mikrobiom interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření panelu analyzovaných metabolitů, kombinace s vysoce rozlišenou hmotnostní spektrometrií a integrace výsledků do machine learning-ových nástrojů. Metoda může podpořit personalizovanou medicínu a vývoj mikrobiálně zacílených nutričních či farmakologických intervencí.

Závěr

Optimalizovaná IP-RP dMRM LC/QQQ metoda spolehlivě kvantifikuje indolové metabolity střevní mikrobioty v širokém dynamickém rozsahu. Její robustnost, citlivost a reprodukovatelnost ji předurčují pro rutinní aplikace v biomedicínském výzkumu.

Reference

1. Dodd D. et al., A Gut Bacterial Pathway Metabolizes Aromatic Amino Acids into Nine Circulating Metabolites. Nature 2017, 551, 648–652.
2. Guo C.J. et al., Discovery of Reactive Microbiota-Derived Metabolites that Inhibit Host Proteases. Cell 2017, 168, 517–526.
3. Cohen L.J. et al., Commensal Bacteria Make GPCR Ligands that Mimic Human Signaling Molecules. Nature 2017, 549, 48–53.
4. Milshteyn A. et al., Accessing Bioactive Natural Products from the Human Microbiome. Cell Host Microbe 2018, 23, 725–736.
5. Palego L. et al., Tryptophan Biochemistry: Structural, Nutritional, Metabolic, and Medical Aspects in Humans. J. Amino Acids 2016, 2016, 8952520.
6. Hendrikx T.; Schnabl B., Indoles: Metabolites Produced by Intestinal Bacteria Capable of Controlling Liver Disease Manifestation. J. Intern. Med. 2019.
7. Venkatesh M. et al., Symbiotic Bacterial Metabolites Regulate Gastrointestinal Barrier Function Via the Xenobiotic Sensor PXR and Toll-Like Receptor 4. Immunity 2014, 41, 296–310.
8. Wlodarska M. et al., Indoleacrylic Acid Produced by Commensal Peptostreptococcus Species Suppresses Inflammation. Cell Host Microbe 2017, 22, 25–37.
9. Rothhammer V.; Quintana F.J., The Aryl Hydrocarbon Receptor: An Environmental Sensor Integrating Immune Responses in Health and Disease. Nat. Rev. Immunol. 2019, 19, 184–197.
10. Lamas B.; Natividad J.M.; Sokol H., Aryl Hydrocarbon Receptor and Intestinal Immunity. Mucosal Immunol. 2018, 11, 1024–1038.
11. Rothhammer V. et al., Microglial Control of Astrocytes in Response to Microbial Metabolites. Nature 2018, 557, 725–728.
12. Cervantes-Barragan L. et al., Lactobacillus reuteri Induces Gut Intraepithelial CD4+ CD8αα+ T cells. Science 2017, 357, 806–810.
13. Lamas B. et al., CARD9 Impacts Colitis by Altering Gut Microbiota Metabolism of Tryptophan into Aryl Hydrocarbon Receptor Ligands. Nat. Med. 2016, 22, 598–605.
14. Chimerel C. et al., Bacterial Metabolite Indole Modulates Incretin Secretion from Intestinal Enteroendocrine L Cells. Cell Reports 2014, 9, 1202–1208.
15. Bhattarai Y. et al., Gut Microbiota-Produced Tryptamine Activates an Epithelial G-Protein-Coupled Receptor to Increase Colonic Secretion. Cell Host Microbe 2018, 23, 775–785.