Developing an assay for tryptophan metabolites in order to determine their impact on the pathogenicity of Chlamydia trachomatis

Význam tématu

Indol je aromatická molekula produkovaná mnoha bakteriemi, která hraje klíčovou roli jako signální látka v bakteriálních komunitách střeva a genitálního traktu. Chlamydia trachomatis je tryptofanový auxotrof, jenž při imunitním tlaku hostitele využívá exogenní indol k syntéze tryptofanu.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem bylo vyvinout netargetovanou GC/MS metodiku pro detekci a relativní kvantifikaci tryptofanových metabolitů (včetně indolu) na modelu Escherichia coli. Získaná data poslouží k analýze klinických vzorků genitálního traktu a ke studiu souvislostí s patogenními projevy C. trachomatis.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky kmene MC1061 (wild type) a TM1061 (tnaA/B-deficientní) kultivované v médiu Luria-Bertani s/bez 100 μg/mL ampicilinu. Odběry po 5 a 9 hodinách, sonikace, precipitace metanolem, sušení na SpeedVac.
Derivace: metoxymace karbonylových skupin a následná silylace pomocí MSTFA+1 % TMCS.
Chromatografie: Agilent 6890 GC s 5975 MSD vybavený velkokapacitním ProSep inletem. Dva DB-5ms sloupce (15 m × 0,25 mm × 0,25 μm) spojené pomocí Purged Ultimate Union. Teplotní program: 60 °C (1 min) → 325 °C při 10 °C/min (3,5 min), backflush 6,5 min; tok helia 1,2 mL/min; injekce split 1:10.
Analýza dat: chromatografická dekonvoluce v MassHunter Qual, statistické vyhodnocení v Mass Profiler Professional; filtrace na základě model ionů, retence, fold change > 2 a p < 0,05; vizualizace pomocí PCA a volcano plot.

Hlavní výsledky a diskuse

Ampicilin indukuje produkci indolu pouze u kmenů MC1061, nikoli u TM1061 (tnaA/B knockout). Exogenní indol vstupuje do obou kmenů, ale expresi tna operonu aktivuje pouze ve wild type. PCA zřetelně odděluje oba kmeny a volcano plot ukazuje signifikantní navýšení koncentrace tryptofanových metabolitů (p < 0,05) u MC1061. Dekonvoluce prokázala detekci putrescinu poblíž hranice detekce, což potvrzuje citlivost metody.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlý a robustní netargetovaný profil malých polárních metabolitů.
• Aplikovatelnost na klinické vzorky genitálního traktu pro monitoring markerů C. trachomatis infekcí.
• Užitečné nástroje pro výzkum, QA/QC a průmyslovou analytiku.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Vyvinutí cílené kvantitativní metody s použitím vnitřních standardů a plnou validací.
• Integrace hyphenovaných technik (LC-MS/MS) pro rozšířenou metabolomiku.
• Automatizace přípravy vzorků a pokročilá datová integrace pro diagnostiku infekcí.

Závěr

Byla implementována netargetovaná GC/MS metodika pro detekci a relativní kvantifikaci tryptofanových metabolitů na modelu E. coli. Metoda umožňuje rozlišit genotypové varianty dle metabolického profilu a poskytuje pevný základ pro klinické aplikace v oblasti genitálních infekcí.

Reference

Palazoglu M., Fiehn O. Application Note 5990-3638en. Agilent Technologies.
Kind T., Wohlgemuth G., Lee do Y., et al. Retention time locked metabolite library. Anal Chem. 2009;81:10038.