Quantitation of Chemical-Induced Deamidation and Oxidation on Monoclonal Antibodies

Význam tématu

Monoklonální protilátky často podléhají chemickým modifikacím, jako je deamidace Asn, izomerizace Asp a oxidace Met, které mohou ovlivnit jejich stabilitu a biologickou aktivitu. Přesná identifikace a kvantifikace těchto změn je zásadní pro kontrolu kritických jakostních atributů (CQA) během vývoje, skladování a formulace bioterapeutik.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie je demonstrovat integrovaný workflow pro simultánní identifikaci a kvantifikaci chemicky indukované deamidace a oxidace na rekombinantních monoklonálních protilátkách (mAb) pomocí Agilent AssayMAP Bravo, 1290 Infinity II LC, 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF a softwaru MassHunter BioConfirm.

Použitá instrumentace

• Agilent AssayMAP Bravo system (G5571AA)
• Agilent 1290 Infinity II LC (pumpa G7120A, multisampler G7167B, termostat G7116B)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF (G6549A) s dual JetStream ESI source (G1958-65268)
• Agilent MassHunter BioConfirm 10.0 software

Metodika

Deamidace byla indukována inkubací vzorků mAb1 při 37 °C v Tris-HCl (pH 8,7) po 0, 3, 6 a 13 dnech. Oxidace se prováděla inkubací mAb1 a NISTmAb s H2O2 (0–0,2 % v/v) při pokojové teplotě přes noc. Po lyofilizaci následovala redukce, alkylace a trypsinová digesce na platformě AssayMAP Bravo. Peptidy byly separovány na nabitou C18 kolonu (2,1×150 mm, 2,7 µm) s 30minutovým gradientem na 1290 Infinity II LC. MS analýza probíhala na 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF v režimu vysokého dynamického rozsahu (2 GHz) s iterativním MS/MS (MS1 m/z 300–1700, MS2 m/z 50–1700). Data zpracováno v BioConfirm (10 ppm MS1, 20 ppm MS2, semitryptická pravidla, FDR 0,1 %, fixní a variabilní modifikace dle studie).

Hlavní výsledky a diskuse

Chromatogramy potvrdily separaci sedmi forem modelového peptidu GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK: nepoškozené a různé deamidované/izomerizované varianty. Lokalizace deamidace byla potvrzena pro Asn389, Asn394 a Asn395 s jednou nepřesností u dvojitých forem. Kvantifikace odhalila nejvyšší míru deamidace na Asn389 (>80 % po 13 dnech), střední na kombinovaných Asn394/Asn395 (~18 %) a nízkou na samostatných místech Asn395. Oxidace Met4 vykazovala rostoucí trend s vyššími koncentracemi H2O2, lišící se mezi mAb1 a NISTmAb.

Přínosy a praktické využití metody

Popisovaný workflow nabízí plnou automatizaci přípravy vzorků, vysokou selektivitu i citlivost LC/Q-TOF analýzy a pokročilé softwarové nástroje pro přesnou identifikaci a kvantifikaci PTM. Metoda je vhodná pro stresové a forciprové degradace a podporuje QA/QC procesy v biotechnologickém vývoji.

Budoucí trendy a možnosti využití

Workflow lze rozšířit na další modifikace (např. glykozylace), zlepšit propustnost analýzy, využít strojové učení pro pokročilé vyhodnocení dat a integrovat do bioprodukčních laboratoří. Standardizace postupu napomůže regulatornímu souhlasu a zefektivnění vývoje nových léčiv.

Závěr

Integrovaný přístup kombinuje automatizovanou přípravu vzorků, výkonnou LC/MS analýzu a sofistikované zpracování dat pro spolehlivou a reprodukovatelnou charakterizaci deamidace a oxidace mAb. Metoda významně zlepší kontrolu kvality a podpoří inovační procesy v oblasti bioterapeutik.

Reference

1. Huang L. et al. In vivo deamidation characterization of monoclonal antibody by LC/MS/MS. Anal. Chem. 2005, 77(5), 1432–1439.
2. Vlasak J. et al. Identification and characterization of asparagine deamidation in the light chain CDR1 of a humanized IgG1 antibody. Anal. Biochem. 2009, 392(2), 145–154.
3. Diepold K. et al. Simultaneous Assessment of Asp Isomerization and Asn Deamidation in Recombinant Antibodies by LC-MS following Incubation at Elevated Temperatures. PLoS One 2012, 7(1):e30295.
4. Haberger M. et al. Assessment of chemical modifications of sites in the CDRs of recombinant antibodies: Susceptibility vs. functionality of critical quality attributes. MAbs. 2014, 6(2), 327–339.
5. Agilent Technologies. Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform. Publ. no. 5991-4872EN.
6. Folzer E. et al. Selective Oxidation of Methionine and Tryptophan Residues in a Therapeutic IgG1 Molecule. J. Pharm. Sci. 2015, 104(9), 2824–2831.
7. Robinson N.E., Robinson A.B., Merrifield R.B. Mass spectrometric evaluation of synthetic peptides as primary structure models for peptide and protein deamidation. J. Pept. Res. 2001, 57(6), 483–493.
8. Robinson N.E., Robinson A.B. Prediction of primary structure deamidation rates of asparaginyl and glutaminyl peptides through steric and catalytic effects. J. Pept. Res. 2004, 63(5), 437–448.