Peptide Mapping of Innovator and Biosimilar Monoclonal Antibody Using an Agilent 1290 Infinity UHPLC Coupled to an Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS System

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčovou součástí vývoje biosimilárních léčiv, protože umožňuje ověření identické aminokyselinové sekvence a posttranslačních modifikací mezi referenčním inovátorem a jeho biosimilárem. Tímto se zajišťuje kvalita, bezpečnost a účinnost finálního výrobku.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem článku bylo porovnat komerční rituximab inovátora a jeho biosimilární variantu pomocí vysokovýkonného UHPLC systému Agilent 1290 Infinity spojeného s Agilent 6550 iFunnel Q-TOF LC/MS. Studie se zaměřila na potvrzení sekvenční podobnosti, analýzu oxidace a deamidace specifických peptidů.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorku byly nejprve disulfidické vazby redukovány DTT a alkylovány iodoacetamidem v denaturačních podmínkách, následovala lyofilizace a trypsinová digesce (enzym : protein 1:20, 37 °C přes noc). Separace peptidů probíhala na chromatografické kolonce AdvanceBio Peptide Mapping (2.1 × 250 mm, 2.7 μm) při gradientu 3–95 % acetonitrilu v 0.1 % kyselině mravenčí, průtok 0.3 ml/min, 60 °C. MS analýza byla prováděna v pozitivním iontovém režimu pomocí Agilent Dual JetStream, rozsah m/z 300–1700 (MS) a 50–1700 (MS/MS). Data zpracovávala softwarová platforma Agilent MassHunter Qualitative a BioConfirm.

Hlavní výsledky a diskuse

Sekvenční pokrytí trypsinové digesce dosáhlo 95 % pro těžký řetězec a 100 % pro lehký řetězec u obou protilátek. Chromatogramy inovátoru a biosimiláru byly téměř identické s mírnými rozdíly v oblastech C-terminálních peptidů (např. SLSLSPGK a jeho des-lys varianta). Analýza oxidace peptidu DLTMISR odhalila vyšší podíl oxidovaných forem u biosimiláru. Deamidace peptidu GFYPSDIAVEWESNGQPENNYK byla srovnatelná v obou vzorcích (cca 8 %).

Přínosy a praktické využití metody

Díky vysokému rozlišení UHPLC kolony, citlivosti Q-TOF MS a automatizované analýze v BioConfirm lze rychle a spolehlivě porovnávat inovátory a biosimilary v rámci vývoje a kontroly jakosti. Metoda podporuje rozhodování v oblasti výzkumu a výrobních laboratoří.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření aplikace na další posttranslační modifikace, zvýšená automatizace pomocí strojového učení v analytickém softwaru, integrace do komplexních QA/QC platforem a zrychlení workflow nejen v biotechnologickém průmyslu, ale i v klinické analýze.

Závěr

UHPLC-Q-TOF peptidové mapování představuje robustní a citlivý přístup k hodnocení podobnosti mezi inovátorem a biosimilárem. Kombinace efektních chromatografických vlastností sloupce, výkonné MS detekce a pokročilého softwaru umožňuje komplexní srovnávací analýzu sekvence a modifikací.

Reference

1. FDA Guidance for Industry Biosimilars Definition, 2015.
2. Agilent Technologies Application Note, publication number 5991-5557EN.
3. Agilent Technologies Application Note, publication number 5990-8769EN.
4. Chelius D., Rehder D. S., Bondarenko P. V. Identification and characterization of deamidation sites in the conserved regions of human immunoglobulin gamma antibodies, Anal Chem 2005, 77, 6004-6011.