Monitoring Product Quality Attributes of Biotherapeutics at the Peptide Level Using the Agilent InfinityLab LC/MSD XT System

Význam tématu

Biotherapeutické proteiny, zejména monoklonální protilátky, vyžadují detailní charakterizaci a monitoring klíčových atributů kvality (Product Quality Attributes, PQAs) na molekulární úrovni. Peptidová mapová analýza za pomoci LC/MS umožňuje identifikaci sekvenčních variací, posttranslačních modifikací a glykozylace, které mohou ovlivnit účinnost, bezpečnost i stabilitu léčivého proteinu. Zavedení jednoduchých, robustních a cenově dostupných metod pro rutinní použití v kvalitativních a validovaných prostředích je proto v biotechnologickém průmyslu vysoce žádoucí.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo demonstrovat provozuschopnost jednočočkového LC/MS systému Agilent InfinityLab LC/MSD XT pro komplexní monitorování více klíčových atributů kvality biotherapeutik v jediné analýze. Metoda byla ověřena na referenčním materiálu NISTmAb, zahrnující identifikaci sekvenčních úseků odpovídajících komplementačním determinujícím oblastem (CDR), detekci deamidace, oxidace a glykozylace peptidů.

Použitá metodika

• Stresové indukce: NISTmAb bylo vystaveno 37 °C a pH 8,7 pro deamidaci a 0,002 % H₂O₂ pro oxidaci.
• Úprava vzorku: denaturace, redukce, alkylace a tryptická digesce na platformě Agilent AssayMAP Bravo; desalting a úprava koncentrace ~0,5 µg/µl.
• Chromatografie: Agilent 1290 Infinity II se ZORBAX RRHD 300 Å StableBond C18 kolonkou (2,1 × 150 mm, 1,8 µm); gradientní eluční program (0–90 % organiky) při 0,25 ml/min, 50 °C.
• Hmotnostní spektrometrie: Agilent InfinityLab LC/MSD XT ve skenovacím režimu pozitivního iontu m/z 360–1400, rychlost ciklu 0,62 s.

Použitá instrumentace

• Agilent 1290 Infinity II LC System (High-Speed Pump, Multisampler s chlazením, Multicolumn Thermostat).
• Analytická kolonka Agilent ZORBAX RRHD 300 Å StableBond C18 2,1 × 150 mm.
• Agilent InfinityLab LC/MSD XT s Jet Stream zdrojem.
• Software Agilent OpenLab ChemStation (C.01.09) pro akvizici, zpracování a reporting.

Hlavní výsledky a diskuse

Analýza celkového iontového chromatogramu prokázala vysokou citlivost a rychlé skenovací schopnosti SQ detektoru. Pomocí extrahovaných iontových chromatogramů (EIC) bylo sledováno 15 předem charakterizovaných peptidů, rozdělených do tří kategorií:

• CDR peptidy (L4, L19, L53, H6, H87) pro potvrzení identity protilátky.
• Peptidy podléhající PTM (deamidace H387, oxidace H87, deamidace/oxidace H255) pro kvantifikaci modifikací způsobených stresem.
• Glykopeptidy (H300 – G0F, G1F, G2F) pro stanovení relativní abundancí glykovaných forem.

Výsledky ukázaly nárůst deamidovaných a oxidovaných forem po stresové indukci a spolehlivé vyhodnocení relativních zastoupení glykopeptidů odpovídající publikovaným datům. OpenLab ChemStation umožnila nastavení EIC metodiky, automatickou integraci a inteligentní reporty (tabulky s relativním zastoupením, porovnávací přehledy retencí a intenzit).

Přínosy a praktické využití metody

• Jednoduchá a univerzální metoda pro rutinní peptide mapping biotherapeutik v QC laboratořích.
• Snížení nákladů díky využití SQ systému s rozšířeným m/z rozsahem až do 3000.
• Rychlá příprava vzorku a zpracování dat s podporou regulovaného prostředí (audit trail, elektronické podpisy).
• Možnost opětovné analýzy bez nutnosti nového měření díky údajnému full‐scan spektru.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na jiné třídy biologických léčiv (např. fúzní proteiny, rekombinantní glykoproteiny).
• Integrace s vyspělými databázovými a ECM systémy pro centrální správu výsledků.
• Použití MS/MS fragmentace pro potvrzení modifikačních lokalizací a neznámých variant.
• Implementace umělé inteligence a strojového učení pro automatizované rozpoznání nových PQAs.

Závěr

Prokázali jsme, že Agilent InfinityLab LC/MSD XT systém je schopen spolehlivě a efektivně monitorovat klíčové atributy kvality biotherapeutik na peptidové úrovni v jediné analýze. Díky jednoduché metodice, rozsáhlé dokumentaci a integrovanému softwarovému řešení lze metodu snadno zařadit do rutinních QC procesů s plnou podporou regulatorní shody.

Reference

1. Agilent Technologies, OpenLab CDS ChemStation Edition with Content Management Systems User’s Guide, M8301-90089 Rev. B.
2. Agilent Technologies, OpenLab CDS ChemStation Edition C.01.09, Guide for Administrators, M8305-90019 Rev. B.
3. Agilent Technologies, Automation of Sample Preparation for Accurate and Scalable Quantification and Characterization of Biotherapeutic Proteins Using the Agilent AssayMAP Bravo Platform, publication number 5991-4872EN.
4. Dong Q. et al., The NISTmAb Tryptic Peptide Spectral Library for Monoclonal Antibody Characterization, MAbs 2018, 10(3), 354–369.
5. Dong Q. et al., In-Depth Characterization and Spectral Library Building of Glycopeptides in the Tryptic Digest of a Monoclonal Antibody Using 1D and 2D LC–MS/MS, J. Proteome Res. 2016, 15(5), 1472–1486.
6. Quantitation of Chemical-Induced Deamidation and Oxidation on Monoclonal Antibodies Using Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF and Agilent MassHunter BioConfirm Software, Agilent Technologies, publication number 5994-0406EN.
7. Haberger M. et al., Assessment of Chemical Modifications of Sites in the CDRs of Recombinant Antibodies: Susceptibility versus Functionality of Critical Quality Attributes, MAbs 2014, 6(2), 327–339.