Critical Quality Attribute Monitoring of mAbs at the Intact and Subunit Levels Using a Cost-Effective, Simple and Robust LC/MS Solution

Význam tématu

Rekombinantní monoklonální protilátky (mAbs) patří k nejrychleji rostoucí skupině bioterapeutik. Jejich vysoká strukturní komplexita vyžaduje systematické sledování kritických kvalitativních atributů (CQAs), zejména molekulové hmotnosti a glykosilačního profilu. Robustní, jednoduché a cenově efektivní metody pro QC prostředí usnadňují vývoj a výrobu mAb.

Cíle a přehled studie

Cílem Application Note bylo ověřit použití systému Agilent InfinityLab LC/MSD XT (jednokvadruplový LC/MS, m/z 10–3 000) pro rychlou a přesnou detekci molekulové hmotnosti mAb na úrovni intact proteinu i subjednotek. Pro test byly zvoleny dvě protilátky: standardní NISTmAb a imunoglobulin G1 (mAb1). Ke vzorkům aplikovali čtyři přípravy: ředění intact proteinu, enzymatickou deglykosylaci (PNGase F), štěpení IdeS (FabRICATOR) a částečnou redukci (DTT).

Použitá metodika a instrumentace

Analytická chromatografie:

• Kolona PLRP-S 1000 Å, 2,1×50 mm, 5 µm
• Mobilní fáze A: H₂O + 0,1 % form. kys.
• Mobilní fáze B: ACN + 0,1 % form. kys.
• Teplota kolony 80 °C, průtok 0,5 mL/min

MS detekce:

• Agilent LC/MSD XT s Jet Stream zdrojem
• Suchý plyn 12 L/min (350 °C), plášťový plyn 11 L/min (360 °C)
• Napětí kapiláry 4 500 V, trysky 2 000 V
• Skenovací oblast intact mAb 1 000–3 000 m/z, subjednotky 500–3 000 m/z

Software:

• OpenLab ChemStation C.01.09 pro akvizici a dekonvoluci

Hlavní výsledky a diskuse

1) Intact proteiny: částečný ionizační obal v rozsahu 2 000–3 000 m/z. Deconvoluce identifikovala u NISTmAb pět hlavních glykoform (G0F–G2F) s chybou –21 až –136 ppm a u mAb1 tři glykoformy s chybou –47 až –54 ppm.
2) Deglykosylace: kolaps glykoform na jeden hlavní vrchol (MW ~145 kDa). Chyba pro NISTmAb –7,5 Da/–52 ppm, pro mAb1 +0,2 Da/1 ppm.
3) IdeS štěpení: vznik subjednotek Fc/2 (~25 kDa) a F(ab’)₂ (~98 kDa). U Fc/2 tři glykoformy s chybou –0,9 až –1,3 Da; F(ab’)₂ vrchol bez modifikací s chybou –2,3 až –5,9 Da.
4) Částečná redukce: vznik lehkého řetězce (~23 kDa) s chybou –1,0 až –1,2 Da a těžkého řetězce (~51 kDa) s glykoformami G0F–G2F chybou –4 až +38 ppm.
Celkově systém dosáhl mass error <±70 ppm u většiny vzorků.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá příprava vzorků a analýza intact a subunit úrovně mAb
• Vysoká robustnost a jednoduchá obsluha vhodná pro QC laboratoře
• Cenová efektivita díky jednokvadruplovému systému
• Schopnost sledovat molekulovou hmotnost i glykoformní profil v jednom běhu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace s automatizovanou přípravou vzorků pro vyšší throughput
• Rozšíření metody na další biologické formy (Fc-fúze, bispecifické protilátky)
• Využití pro stabilitní studie a charakterizaci biosimilars
• Možnosti spojení s iontovou mobilitou pro zlepšení separace izobarických forem

Závěr

Systém Agilent InfinityLab LC/MSD XT prokázal spolehlivou a přesnou detekci intact mAb i jejich subjednotek s nízkou hmotnostní chybou a jednoduchou obsluhou. Metoda představuje efektivní nástroj pro QC prostředí v biopharmaceutickém průmyslu.

Reference

• Liu P. et al. Rapid Commun Mass Spectrom. 2019, 33(1), 31–40.
• OpenLab CDS ChemStation Edition with Content Management Systems User's Guide, Agilent, M8301-90089 Rev.B.
• OpenLab CDS ChemStation Edition C.01.09, Guide for Administrators, Agilent, M8305-90019 Rev.B.
• Kilpatrick E.L. et al. Protein Expression Purif. 2012, 85, 94–99.
• Profiling Glycosylation of Monoclonal Antibodies at Three Levels Using the Agilent 6545XT LC/Q-TOF, Agilent, 5991-8796EN.