Analysis of Native Intact Protein Complexes Using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza nativních intact proteinových komplexů hraje klíčovou roli ve studiu jejich strukturálních vlastností, interakcí a funkce v co nejbližších podmínkách přirozeného prostředí. Masová spektrometrie umožňuje zachování nekovalentních vazeb během přechodu do plynné fáze a bez potřeby organických rozpouštědel či silných kyselin nabízí přímé povědomí o složení, stechiometrii a topologii velkých proteinových agregátů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo prokázat schopnost komerčně dostupného přístroje Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS pro kvalitativní a kvantitativní analýzu velkých nativních proteinových komplexů. Pomocí modifikovaného statického nano-ESI zdroje autoři ověřili rozlišení a citlivost pro různé systémy od rozpustných enzymů přes membránové proteiny až po chaperonin GroEL.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly proteiny dialyzovány do 200 mM roztoku amonného octanu, membránový komplex AmtB navíc s detergenty C8E4. Kapiláry z borosilikátu byly taženy na domácím mikropipetovacím zařízení a vsazeny do upraveného držáku s Pt vodičem pro stabilní statické nESI.

• Agilent Dual Nanospray Ion Source (G3253A)
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF Mass Spectrometer

Parametry zdroje (kapilární napětí, fragmentor, skimmer) byly optimalizovány pro minimalizaci disociace a maximální přenos iontů. Kolizní aktivace probíhala v kolizní cely dusíkem při 22 psi zádržného tlaku.

Hlavní výsledky a diskuse

Rozpustné komplexy ADH (147 kDa tetramer) a pyruvát kinázy PK (232 kDa tetramer) byly detekovány s vysoce hladkým distribučním profilem nábojových stavů a naměřenými hmotnostmi v shodě s teoretickými hodnotami, přičemž nízké množství vzorku (picogramy až nanogramy) stačilo pro vysoce kvalitní spektra.
Membránový komplex AmtB (126,9 kDa trimer) vykazoval při vyšší kolizní energii fragmentaci na monomery s jasnými stopy aduktů β-merkaptoethanolu (77 Da).
Chaperonin GroEL (~800 kDa tetradecamer) byl rovněž detekován v nativním 14-mericém stavu s rozlišením mezer mezi nábojovými stavy. Zvýšení zdrojového napětí vedlo k in-source disociaci oligomerů (monomer, dimer, trimer) a k zachycení méně obvyklých forem (např. možný 8-mer s uvězněným monomerem). Kolizní aktivací v buňce se pak prokázalo odštěpení nábojů (charge stripping) a odolnost komplexu vůči aduktům a solným klastěrům.

Přínosy a praktické využití metody

Platforma Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s nano-ESI umožňuje:

• Analýzu rozsáhlých proteinových komplexů nad 800 kDa s vysokou hmotnostní přesností
• Detekci nízkostavových kontaminantů a nekovalentních aduktů
• Studium stability a disociačních procesů pod jemnou kolizní aktivací

Tato metodika nachází uplatnění v proteomice, farmaceutickém výzkumu, QA/QC laboratořích pro kontrolu vyšší struktury proteinů a charakterizaci vazebních interakcí.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další rozšíření rozsahu pozorovatelného m/z, zvýšení rozlišení nábojových stavů a automatizace statického nano-ESI. Kombinace s iontovou mobilitou a pokročilou datovou analýzou umožní detailnější strukturované mapování komplexních směsí proteinů a oligomerů v reálném čase.

Závěr

Studie demonstruje, že neinvazivní statické nano-ESI ve spojení s Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS poskytuje vysoce citlivé a přesné hmotnostní analýzy nativních proteinových komplexů od středních enzymů až po velké multimery nad 800 kDa. Přístrojová citlivost, rozlišení a schopnost zkoumat disociační procesy podtrhují jeho význam pro studium biomolekul ve fyziologických podmínkách.

Reference

• Allison T. et al. Native Protein Mass Spectrometry. Protein Nanotechnology in Methods in Molecular Biology, 2019, 2073, 287–299.
• Patiny L. et al. ChemCalc: a Building Block for Tomorrow’s Chemical Infrastructure. J. Chem. Inf. Model., 2013, 53(5), 1223–1228.
• Liao Y. et al. Removal of N-terminal Methionine from Recombinant Proteins by Engineered E. coli Methionine Aminopeptidase. Protein Sci., 2004, 13(7), 1802–1810.
• McCabe J. et al. First-Principles Collision Cross Section Measurement of Large Proteins and Protein Complexes. Anal. Chem., 2020, 92(16), 11155–11163.