Analysis of Native Intact Protein Complexes Using the Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF Mass Spectrometer

Význam tématu

Analýza nativních intact proteinových komplexů umožňuje zachovat nekovalentní interakce a získat informace o složení, stoichiometrii a topologii makromolekulárních svazků v biologických systémech. Oproti denaturačním podmínkám umožňuje nativní MS studovat proteiny v jejich přirozeném stavu, což je klíčové pro vývoj bioterapeutik, studium protein–proteinových interakcí a membránových komplexů.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit schopnosti komerčního Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS doplněného o statický nESI zdroj pro analýzu intact, nativních proteinových komplexů různých typů: rozpustné enzymy, membránové transportéry a chaperony s molárními hmotnostmi přes 800 kDa. Dalším cílem bylo demonstrovat detekci nízkoabundantních aduktů a produktů disociace.

Použitá metodika a instrumentace

• Instrumentace: Agilent Dual Nanospray Ion Source (G3253A) s upraveným držákem kapiláry obsahujícím Pt drát, Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS
• Příprava vzorků: buffer exchange do 200 mM octanu amonného pomocí gelových kolon Micro Bio-Spin P-6, koncentrace 1–10 µM, membránový komplex doplněn o 0,5 % C8E4
• nESI: borosilikátové kapiláry tažené na P-1000, statický sprej, pozicování 5–10 mm od stínícího kroužku
• Parametry zdroje: optimalizace kapiláry (exit/skimmer), fragmentoru a CE v kolizní buňce N₂ (22 psi) pro minimalizaci disociace a maximalizaci přenosu iontů
• Analýza dat: Agilent MassHunter Qualitative Analysis a BioConfirm, výpočet experimentálních MW z CSD, porovnání s teoretickými hodnotami z UniProt/ChemCalc

Hlavní výsledky a diskuse

Rozpustné komplexy ADH a PK byly detekovány jako homotetramery s CSD 27+ (147,5 kDa) a 36+ (232,0 kDa), včetně nízkoabundantní truncované formy PK. Membránový trimer AmtB se objevil při 16+ (126,7 kDa) s až třemi β-ME adukty (77 Da). Chaperonin GroEL poskytl CSD 74+ (801 kDa) s vysokým rozlišením; zvýšení fragmentorového napětí vyvolalo in-source disociaci na monomery, dimery a trimery a odhalilo možný 8-mer zachycující monomer v dutině.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda vyžaduje mikrogramové množství vzorku, zachovává nekovalentní interakce a poskytuje vysoké rozlišení pro komplexy >800 kDa. Umožňuje kvantifikaci aduktů, analýzu stoichiometrie a identifikaci contaminantů, což je užitečné pro vývoj bioterapeutik, QA/QC a strukturální výzkum.

Budoucí trendy a možnosti využití

Rozšíření o chromatografii, iontovou mobilitu, cross-linking a top-down proteomiku. Aplikace v charakterizaci interakcí protein–ligand, membránových komplexů, studiu dynamiky oligomerizace a high-throughput analýze.

Závěr

Upravený statický nESI zdroj na Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF MS prokázal vynikající citlivost a rozlišení při analýze nativních intact proteinových komplexů od mikrogramových vzorků až po molární hmotnosti přes 800 kDa, včetně detekce aduktů a disociačních produktů bez úprav komerčního přístroje.

Reference

• Allison T. et al. Native Protein Mass Spectrometry. Methods Mol. Biol. 2019, 2073, 287–299
• Patiny L. et al. Chemcalc: a Building Block for Tomorrow’s Chemical Infrastructure. J. Chem. Inf. Model. 2013, 53(5), 1223–1228
• Liao Y. et al. Removal of N-terminal Methionine from Recombinant Proteins by Engineered E. coli Methionine Aminopeptidase. Protein Sci. 2004, 13(7), 1802–1810
• McCabe J. et al. First-Principles Collision Cross Section Measurement of Large Proteins and Protein Complexes. Anal. Chem. 2020, 92(16), 11155–11163