High Sensitivity Analysis of Diarrhetic Shellfish Poisoning (DSP) Toxins Using Liquid Chromatography Tandem Mass Spectrometry

Význam tématu

Diarrhetic shellfish poisoning (DSP) je způsobena lipofilními toxiny produkovanými řasami a akumulovanými v měkkýších. Tyto látky (okadová kyselina, dinofysistoxiny, pectenotoxiny, yessotoxin) představují závažné riziko pro spotřebitele. Tradiční metoda monitoringu pomocí bioasay e s myší je nahrazována citlivějšími a selektivními chromatograficko-hmotnostními technikami, které umožňují kvantifikovat volné i vázané formy toxinů a vyhovět striktním regulačním limitům.

Cíle a přehled studie

Cílem prezentované studie bylo vyvinout a ověřit metodiku LC–MS/MS pro simultánní screening šesti hlavních DSP toxinů (OA, DTX1, PTX1, PTX2, PTX6, YTX) a kvantifikaci okadové kyseliny a dinofysistoxinu 1 v měkkýších. Metoda byla validována podle EU harmonizovaného postupu a implementována do japonské legislativy od března 2015 jako oficiální náhrada myší bioassay.

Použitá metodika

Vzorové matrix (midgut gland měkkýšů) bylo extrahováno dvoustupňově metanolem, následovalo centrifugování a filtrace:

• Krok 1 – extrakce 2 g homogenátu 9 mL metanolu, promíchání, centrifugace, opakování extrakce a doplnění na 20 mL.
• Krok 2 – alkalická hydrolýza 1 mL extraktu 1 v 2,5 M NaOH při 76 °C (40 min), neutralizace HCl, filtrace (extrakt 2).
• Analýza MRM módem detekce volných a celkových (po hydrolýze) obsahů OA a DTX1.

Použitá instrumentace

• UHPLC systém: Nexera UHPLC; kolona L-column2 ODS (50 × 2,1 mm, 2 µm).
• Mobilní fáze: A – vodný roztok 2 mM ammonium formiátu a 50 mM kyseliny formiové; B – acetonitril/voda 95/5 s 2 mM ammonium formiátu a 50 mM kyseliny formiové; gradient 30→100 % B během 0–10 min, průtok 0,2 mL/min, teplota kolony 20 °C, objem injekce 5 µL.
• MS/MS: Shimadzu LCMS-8050, ESI negativní mód, iontizační napětí ‑3,0 kV, MRM přechody OA (m/z 803,5>255,2; 803,5>113,0), DTX1 (817,5>255,2; 817,5>113,0).

Hlavní výsledky a diskuse

Linearity kalibrace OA a DTX1 dosáhly v rozsahu 0,04–20 ppb r2 > 0,999. LOQ byly 0,005 ppb pro OA (S/N 75) a 0,01 ppb pro DTX1 (S/N 39). Opakovatelnost (%RSD) při 0,1 ppb činila 4,2 % (OA) a 8,1 % (DTX1). Matrixové efekty byly hodnoceny prostřednictvím 10× a 100× ředění, při 10× ředění se recoveries pohybovaly mezi 96–119 % (OA) a 99–113 % (DTX1). Ve vzorcích z trhu byly naměřeny estery OA a DTX1 v hladinách 17,4 µg/kg a 32,8 µg/kg (scallop) a 6,0 µg/kg volného DTX1, což je pod limitem 160 µg OA ekv./kg.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda nabízí vysokou citlivost, selektivitu a krátký čas analýzy vhodný pro rutinní monitoring, splňuje požadavky EU harmonizovaného SOP a japonské legislativy. Umožňuje zároveň odděleně kvantifikovat volné i vázané formy toxinů bez nutnosti zdlouhavého zpracování vzorku.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj zahrnuje optimalizaci čistících kroků (SPE), rozšíření na širší spektrum analogů DSP toxinů a automatizované přípravné platformy. Perspektivní je také použití vysokorozlišovací MS pro víceklasové stanovení mořských toxinů v jednom běhu.

Závěr

Vyvinutá LC–MS/MS metoda s použitím Shimadzu LCMS-8050 prokázala vynikající citlivost, přesnost i lineární odezvu a je vhodná pro nahrazení bioassay při monitoringu DSP toxinů. Implementace metody umožňuje spolehlivé hodnocení bezpečnosti měkkýšů v souladu s mezinárodními a národními předpisy.

Reference

• EU-Harmonized Standard Operating procedure for determination of lipophilic marine biotoxins in molluscs by LC-MS/MS Ver. 4.
• T. Suzuki, M. A. Quilliam, Analytical Sciences 27 (2011) 571–584.