Comprehensive Two-Dimensional HPLC and Informative Data Processing for Pharmaceuticals and Lipids

Význam tématu

Komplexní dvěma dimenzemi řízená kapalinová chromatografie (2D-LC) umožňuje vysokou separační sílu a rozlišení, které nelze dosáhnout běžnými jednorozměrnými technikami. Tato metoda je klíčová pro analýzu složitých matric, jako jsou bylinné lékové přípravky a biologické lipidy, kde se kombinuje široké spektrum chemických látek různých vlastností.

Cíle a přehled studie

Cílem bylo demonstrovat schopnost přístroje Nexera-e (Shimadzu) v kombinaci s pokročilou datovou analýzou pro kvantitativní, kvalitativní a diferenční analýzu:

• Herbální přípravek Kakkonto – separace klíčových markerů (ephedrin, glycyrrhizin, cinnamová kyselina) a stanovení glycyrrhizinu.
• Glycerofosfolipidy – kvantifikace fosfatidylcholinů (PC), fosfatidylethanolaminů (PE) a fosfatidylglycerolů (PG) a kvalitativní identifikace lipidových druhů.

Použitá metodika

Pro Kakkonto byla zvolena kombinace polárně reverzní chromatografie (1. dimenze, pH 6,8) a rychlé reverzní fáze (2. dimenze, pH 2,6) s modulací objemu 50 μL po 60 s. Pro lipidy se využila normální fáze (1. dimenze) a C18 reverzní fáze (2. dimenze) v krokovém gradientu. Sleduje se jak konstantní, tak automatický gradient pro optimalizaci rozlišení.

Použitá instrumentace

• Shimadzu Nexera-e – kompaktní 2D-LC platforma
• Kolony: Shim-pack XR ODSII, Kinetex C18, Nucleosil SIL
• Detekce UV/PDA: SPD-M30A (254 nm)
• Hromadová spektrometrie: LCMS-8050 (MS/MS, ESI+, MRM) a LCMS-IT-TOF (ESI±, vysoké rozlišení)

Hlavní výsledky a diskuse

V případě Kakkonta auto-gradient zpřesnil pík glycyrrhizinu a umožnil lineární kvantifikaci v rozmezí 50–1000 μg/L s r2=0,9998 a RSD <5 %. Diferenční analýza dvou komerčních produktů odhalila odlišné profily kontaminant a složení pomocí porovnávacích 3D konturových zobrazení. U glycerofosfolipidů bylo dosaženo lineárního rozsahu 50–5000 μg/L (r2=0,9999) a opakovatelnosti MRM kvantifikace s RSD <5 %. IT-TOF scan potvrdil oddělení PC, PE a PG v pozitivním/negativním módu a databázová analýza „Lipid search“ identifikovala molekuly s přesností m/z.

Přínosy a praktické využití metody

Metoda 2D-LC na Nexera-e poskytuje:

• Vysokou ortogonalitu separace i ve složitých matricích
• Spolehlivou kvantifikaci a identifikaci v jednom běhu
• Možnost diferenční analýzy mezi vzorky pro kontrolu kvality a výzkum

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se rozšíření využití komplementárních detektorů, automatizace modulačních procesů a integrace s bioinformatickými nástroji pro hlubší lipidomické a metabolomické studie. Rovněž je perspektivní miniaturizace a zvýšení propustnosti pro rutinní nasazení v klinických a potravinářských laboratořích.

Závěr

Studie prokázala, že platforma Nexera-e kombinuje vysokou separaci, citlivost a reprodukovatelnost pro komplexní analýzu farmaceutických a lipidových vzorků. Spojení odlišných separačních módů s PDA, MS/MS a IT-TOF detekcí umožňuje komplexní kvantitativní, kvalitativní a diferenční analýzu v jednom workflow.

Reference

• Shimadzu Corporation. Comprehensive Two-Dimensional HPLC and Informative Data Processing for Pharmaceuticals and Lipids. Application Note PO-CON1576E. 2015.