Peptide Mapping of Monoclonal Antibody (mAb) Using Nexera Bio with Q-TOF Mass Spectrometer for Full Sequence Confirmation

Význam tématu

Peptidové mapování monoklonálních protilátek je klíčovou metodou v kvalitativní kontrole a potvrzení primární struktury biotechnologických léčiv. Zajišťuje jednoznačnou identifikaci aminokyselinové posloupnosti, odhaluje případné varianty či modifikace a podporuje porovnání biosimilárních produktů s referenčním originálem.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo ověřit robustnost a opakovatelnost biokompatibilního UHPLC systému Nexera Bio pro chromatografické profilování tryptických štěpků lidské imunoglobulinu G a biosimilárního bevacizumabu a následně potvrdit sekvenci peptidů přesnou hmotnostní analýzou na Q-TOF LCMS-9030.

Použitá metodika a instrumentace

Pro přípravu vzorků byly proteiny redukovány DTT, alkylovány iodoacetamidem a tráveny trypsinem při 37 °C po dobu 4 hodin. K zastavení reakce se přidalo TFA a následovala centrifugace. Analýzu chromatografického profilu realizační Nexera Bio UHPLC systém se sloupcem Shim-pack GISS C18 (250×4,6 mm, 5 µm), mobilní fáze A 0,1 % TFA ve vodě, B 0,1 % TFA v acetonitrilu, gradient 115 minut, 1,0 mL·min⁻¹, teplota 40 °C, detekce PDA (210 nm). Pro hmotnostní potvrzení se stejná kolona a podmínky aplikovaly na LCMS-9030 Q-TOF s ESI v pozitivním módu, TOF rozsah 250–2500 m/z, plyny: dusík a čistý vzduch při optimalizovaných průtocích.

Hlavní výsledky a diskuse

Intra- i interdenní opakovatelnost retenčních časů vybraných peptidů lidské IgG dosáhla RSD pod 0,5 %, což potvrzuje stabilitu metody. Chromatogramy tryptických štěpků bevacizumabu vykázaly téměř identický profil UV a různé špičky detekované Q-TOF ukázaly 100% pokrytí sekvence přípravku včetněC-terminálních a post-translačních modifikací. Hmotnostní chyby byly v rozmezí ±2 ppm a prokázaly vysokou přesnost přiřazení, např. SLSLSPG s –1,1 ppm a ALPAPIEK s +0,6 ppm.

Přínosy a praktické využití metody

• Zajištění spolehlivého potvrzení aminokyselinové sekvence a integrity protilátek.
• Podpora QA/QC procesů ve výrobě biopharma přípravků.
• Porovnání biosimilárních produktů s referenčními originály pro registraci a validaci.
• Detekce variací, modifikací a možných degradací v primární struktuře.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Integrace automatizovaného vzorkování a vysokopropustných platforem.
• Propojení s iontovou mobilitou pro hloubkovou charakterizaci proteoform.
• Real-time monitoring procesů výroby monoklonálních protilátek.
• Využití umělé inteligence pro rychlou interpretaci hmotnostních dat.

Závěr

Studie potvrdila, že kombinace UHPLC Nexera Bio a Q-TOF LCMS-9030 představuje vysoce reprodukovatelnou a přesnou platformu pro peptidové mapování monoklonálních protilátek a biosimilárních léčiv. Dosahuje 100% sekvenčního pokrytí, vysoké opakovatelnosti retenčních časů a přesnosti hmotnostní analýzy, což ji činí vhodnou pro biopharma výzkum a výrobní kontrolu.

Reference

1. Shimadzu Corporation. Peptide Mapping of Antibody Drugs by Nexera-i. Application News L488, 2015.
2. US FDA. Quality Considerations in Demonstrating Biosimilarity of a Therapeutic Protein Product to Reference Product. Guidance for Industry, 2015.
3. Skyline Wiki. Accurate Mass Matching in Peptide Mapping. skyline.ms/wiki.