Evaluation of search engines for phosphopeptide identification and quantitation

Význam tématu

Identifikace a kvantifikace fosfopeptidů je klíčová pro pochopení regulačních mechanismů post-translačních modifikací v buňce. Fosforylace ovlivňuje signalizaci, metabolismus a buněčné procesy, proto přesné nástroje pro analýzu fosfoproteomu usnadňují identifikaci nových biologických cílů a validaci terapeutických markerů.

Cíle a přehled studie

Studie hodnotí výkon různých vyhledávacích algoritmů (Sequest HT, Mascot, Byonic, Andromeda v MaxQuant) při analýze fosfopeptidů získaných z obohaceného a multiplexovaného vzorku. Hlavním cílem bylo porovnat určité fragmentační režimy (HCD, CID, EThcD, MSA-CID) a ověřit kvantitační přesnost pomocí isobarického značení (TMT 10-plex) v modelech s lidským a drožďovým proteomem.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky HeLa buněk a droždí byly digesovány, obohaceny o fosfopeptidy technikou Fe-NTA a značené TMT 10-plex. Multiplexované vzorky se chromatograficky dělily na Easy-nLC 1000 s 50 cm EASY-Spray kolonkou a analyzovaly na Orbitrap Fusion Lumos. Srovnány byly fragmentační metody:

• HCD (orbitrap, vysoké rozlišení MS2)
• CID (ion-trap MS2)
• EThcD (ETD se suplementárním HCD)
• MSA-CID (multistage activation s orbitrap detekcí)

K vyhledávání dat sloužila platforma Proteome Discoverer 2.1 a MaxQuant 1.5.3.51. Použity fixní (karbamidomethylace C, TMT na N-terminu a lysinu) a dynamické modifikace (oxidace M, deamidace NQ, fosforylace STY). Filtroval se 1 % FDR na úrovni peptidů i proteomů a lokalizační pravděpodobnost fosforylace ≥ 90 % (ptmRS nebo Andromeda score).

Hlavní výsledky a diskuse

HCD poskytlo nejvyšší či druhý nejvyšší počet fosfopeptidových identifikací ve všech vyhledávačích. EThcD zaostával kvůli nižší rychlosti skenování, ale přispíval k doplňkovým identifikacím. MSA-CID zlepšil průnik identifikací mezi CID a HCD až o 21 %.
Byonic vykázal nejvyšší počet celkových i lokalizačně jistých fosfosít a bioinformatic­ké score často favorizovalo neutral loss signály. Sequest HT a MaxQuant s Andromedou měly srovnatelnou identifikaci, Mascot mírně zaostával.
Kvantitativní část se dvěma proteomy (HeLa vs. droždí) prokázala, že po korekci izotopických faktorů a použití SPS MS3 jsou TMT poměry na lidském proteomu soustředěny kolem očekávané hodnoty log2(8:1)≈3. Měřená přesnost byla podobná napříč všemi enginy.

Přínosy a praktické využití metody

Optimalizace fragmentačních režimů a výběr vyhledávacího enginu umožňuje maximalizovat počet identifikovaných fosfopeptidů a jistotu lokalizace fosforylačních míst. Multiplexní TMT kvantifikace s SPS MS3 eliminuje interference izobarických kanálů, což zajišťuje robustní měření relativních změn fosforylace mezi podmínkami. Tento přístup je vhodný pro biomedicínský výzkum i farmaceutický vývoj.

Budoucí trendy a možnosti využití

Nové fragmentační kombinace zdokonalu­jí hloubku pokrytí fosfoproteomu. Rozvoj AI-podpo­řených algoritmů pro scoring a lokalizaci PTM dále zvýší selektivitu a citlivost. Předpokládá se nástup dalších isobarických značících reagentů s vyšší multiplexací a zlepšenou chemickou stabilitou. Integrace dat z ion-mobility spektrometrů a hlubší využití strojového učení nabídnou komplexnější pohled na fosfoproteomiku v širších biologických kontextech.

Závěr

Pro analýzu fosfoproteomu se HCD jako primární fragmentace ukázalo za stávajících podmínek zařazeno mezi nejefektivnější. Byonic poskytuje nejvíce jistých lokalizací, Sequest HT a MaxQuant nabízejí vyvážený výkon. Multiplexní TMT kvantifikace s SPS MS3 zajišťuje konzistentní a přesné poměry i v komplexních vzorcích.

Reference

• Marx H. et al. Nat Biotechnol. 2013;31(6):557–564.
• Nagaraj N. et al. J Proteome Res. 2010;9(12):6786–6794.
• Frese C. et al. J Proteome Res. 2013;12(3):1520–1525.
• Schroeder M. et al. Anal Chem. 2004;76:3590–3598.
• Jiang X. et al. ASMS poster 2016: Sensitive and accurate quantitation of phosphopeptides using TMT isobaric labeling.