High-Resolution Sampling 2D-LC for Pharmaceutical Impurity Analysis

Význam tématu

Analýza stopových nečistot v léčivých látkách je klíčová pro zajištění kvality, účinnosti a bezpečnosti farmaceutických přípravků. Strukturálně příbuzné látky se aktivní složkou (API) mohou koelutovat a jejich koncentrace často klesá pod úroveň snadno detekovatelnou jednorozměrnou chromatografií. Vyspělá dvourozměrná chromatografie (2D-LC) s vysokým rozlišením vzorkování nabízí citlivou a selektivní metodu pro separaci a kvantifikaci nečistot při úrovních stanovených mezinárodními normami (ICH Q3A).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem aplikace je demonstrovat použití vysokého rozlišení vzorkování (HiRes) v 2D-LC pro detekci nečistot, které se ve 1D chromatogramu skrývají pod vrcholem hlavní látky. Jako modelové systémy byly použity standardy chlorodifluorobenzoových kyselin při poměru 100 % vs. 0,05–0,15 % a jako reálný vzorek deamidovaný inzulin analyzovaný s hmotnostní spektrometrií (MS).

Použitá metodika a instrumentace

Princip HiRes 2D-LC spočívá ve více drobných frakcích (cuts) odebraných přesně v čase dostatečně hustě k pokrytí celé šířky piků ve 1D. Jednotlivé frakce jsou shromážděny do smyček a secvenčně analyzovány v 2D.

• Hlavní část: Agilent 1290 Infinity II 2D-LC Solution (High Speed Pumps, Multisampler s chlazením, Multicolumn Thermostats, Diode Array Detectors, Valve Drive s 2poz/4port duo a MHC ventily).
• Druhý rozměr: separace na C18, PAH nebo Bonus RP kolona v závislosti na analýze.
• Detekce UV-DAD: standardní DAD nebo HDR-DAD Impurity Analyzer pro rozšířený dynamický rozsah.
• 2D-LC/MS: Agilent 6545 Q-TOF s Dual Jet Stream ESI pro identifikaci peptidových variant.
• Software: Agilent OpenLAB CDS ChemStation, 2D-LC Software AddOn, MassHunter Workstation a 2D Chromatogram Creator.

Hlavní výsledky a diskuse

• Chlorodifluorobenzoové kyseliny: tři isomery při poměrech 100 % vs. 0,05 % (Mix 1), 0,10 % (Mix 2) a 0,15 % (Mix 3) nebyly ve 1D plně separovatelné. HiRes 2D-LC umožnilo detekci a kvantifikaci nečistoty (5-chloro-2,4-difluorobenzoová kyselina) s přesností 71,6–108,5 % a RSD 2,71–7,95 % pomocí standardního DAD. Při použití HDR-DAD se přesnost zlepšila na 96,4–108,5 % a RSD se snížilo pod 1,6 %.

Deamidovaný inzulin: real-world vzorek podstoupil HiRes 2D-LC/MS, což vedlo k zachycení a identifikaci jedné deamidované formy díky charakteristickému posunu izotopického vzorce [M+5H]5+ o 0,98 Da. 2D Chromatogram Creator umožnil vizualizaci jednotlivých frakcí v MS a UV signálu.

Přínosy a praktické využití metody

HiRes 2D-LC umožňuje:

• Detekci nečistot skrytých pod dominantním vrcholem API ve 1D.
• Udržení vysoké kvality kvantifikace i při velkém rozdílu koncentrací analyzované látky a nečistot.
• Eliminaci iontového potlačení díky funkci desaltingu v druhém rozměru.
• Jednoduchou přepínatelnost mezi režimy LC×LC, MHC a HiRes 2D-LC.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Další rozšíření dynamického rozsahu detektoru a integrace HDR-DAD s HRMS.
• Automatizace a prediktivní nastavení cutů na základě strojového učení.
• Aplikace v biotechnologickém QA/QC pro komplexní proteiny a peptidy.
• Kombinace 2D-LC s ion mobility spektrometrií pro vyšší rozlišení izomerů.

Závěr

Vysokorozlišovací vzorkování 2D-LC se ukázalo jako spolehlivá a citlivá metoda pro analýzu nízkokoncentrovaných nečistot v přítomnosti strukturálně podobných hlavních látek. Použití HDR-DAD a MS detekce dále zlepšuje přesnost a selektivitu a otevírá cestu k rozsáhlému využití v farmaceutické výrobě a kontrolách kvality.

Reference

• International Council for Harmonisation of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use. ICH Q3A(R2) Impurities in New Drug Substances, 2006.
• Venkatramani C.; et al. Assessing Stability-Indicating Methods for Coelution by Two-Dimensional Liquid Chromatography with Mass Spectrometric Detection. Journal of Separation Science. 2014, 37(20), 3214–3225.
• Petersson P.; Haselmann K.; Buckenmaier S. Multiple Heart-Cutting Two-Dimensional Liquid Chromatography Mass Spectrometry: Towards Real Time Determination of Related Impurities of Bio-Pharmaceuticals in Salt Based Separation Methods. Journal of Chromatography A. 2016, 1468, 95–101.
• Stephan S. High-Resolution Sampling 2D-LC with the Agilent 1290 Infinity II 2D-LC Solution. Agilent Technologies Technical Overview. 2016.
• Schneider S. 2D-LC/MS Characterization of Charge Variants Using Ion Exchange and Reversed-Phase Chromatography Multiple Heart-Cutting 2D-LC Analysis of Innovator versus Biosimilar Monoclonal Antibodies. Agilent Technologies Application Note. 2016.