Advanced 2D-LC/MS Workflow for the Characterization of Semaglutide and Its Impurities

Význam tématu

Charakterizace a analýza nečistot terapeutických peptidů, jako je semaglutide, je klíčová pro zajištění kvality a bezpečnosti biopharmaceutik. Díky strukturní rozmanitosti peptidových API představují nízce zastoupené izomery a fragmenty analytickou výzvu při konvenčních jednorozměrných LC/MS metodách. Použití dvourozměrné kapalinové chromatografie (2D-LC) v kombinaci s vysokorozlišovacím Q-TOF hmotnostním spektrometrem umožňuje účinné oddělení, desalting a detailní identifikaci peptidových nečistot na základě přesné hmoty a sekvenčního potvrzení.

Cíle a přehled studie

Hlavním cílem studie bylo vyvinout robustní 2D-LC/MS workflow pro detailní charakterizaci semaglutidu a jeho souvisejících nečistot vznikajících během syntézy či degradačních procesů. Konkrétně autoři představují:

• integraci Agilent 1290 Infinity III bio 2D-LC systému s Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF,
• nasazení víceřezové techniky (Multiple Heart-Cutting, MHC) a HiRes sampling pro cílený přenos frakcí do 2D,
• využití softwaru MassHunter BioConfirm pro automatizované mapování peptidových sekvencí a modifikací.

Použitá metodika a instrumentace

Workflow se skládá ze dvou chromatografických dimenzí:

• První dimenze (1D): Agilent AdvanceBio Peptide Plus C18 kolona, objem vzorku 20 µL, 25 mM fosfátový pufr pH 4,5 pro vysokou rozlišitelnost peptidů (nekompatibilní s MS),
• Druhá dimenze (2D): Agilent AdvanceBio RP-mAb C4 kolona, mobilní fáze s 0,1 % kyselinou mravenčí pro desalting a MS kompatibilitu,
• Agilent 1290 Infinity III bio 2D-LC systém s MHC ventily a biokompatibilními smyčkami 40 µL,
• Agilent 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF s Dual Jet ESI zdrojem, parametry: 325 °C, 11 L/min, m/z 300–3200, rozlišení 2 GHz,
• Software: MassHunter Workstation LC/MS v11.0, 2D-LC software, MassHunter BioConfirm v12.1.

Hlavní výsledky a diskuse

Popis experimentů:

• Experiment 1: Cílené HiRes řezy před hlavní peakou semaglutidu detekovaly izomerické nečistoty a fragmenty (7–31, 19–21) potvrzené MS/MS s chybou < 5 ppm.
• Experiment 2: Víceřezové HiRes řezy na hlavním peak a post-main oblasti odhalily celou škálu fragmentů (2–31, 3–31) a variabilní modifikace, včetně des-Aib a des-H.

Diskuse klíčových bodů:

• Orthogonální kolony v 1D a 2D maximalizují separaci i pro velmi podobné struktury.
• MHC a HiRes sampling zajišťují efektivní zachycení širokých a úzkých chromatografických špiček bez ztráty informace.
• BioConfirm automatizuje sekvenční přiřazení, variabilní modifikace a intact mass detekci.

Přínosy a praktické využití metody

Navržené řešení poskytuje:

• Rychlý screening nízkomolekulárních nečistot i degradovaných fragmentů peptidů.
• Vysokou přesnost hmotnostního určení (< 5 ppm) pro kvalitativní i kvantitativní analýzy.
• Modulární nastavení pro různé typy peptidových API a bufferových systémů.
• Komplexní workflow vhodné pro QC laboratoře, vývojové týmy i regulatoře.

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekávané směry rozvoje:

• Integrace pokročilé automatizace a AI-řízení výběru frakcí pro další zvýšení throughput.
• Zavádění ultrarychlých 2D metod s nano-LC nebo kapilárními systémy pro vzorky s omezeným objemem.
• Propojení s iontovým mobilitním spektrometrem pro ještě lepší oddělení izomerů.
• Standardizované databáze peptidových modifikací a otevřené formáty dat pro širší sdílení a validaci výsledků.

Závěr

Prezentované 2D-LC/MS řešení s Agilent 1290 Infinity III bio a 6545XT AdvanceBio LC/Q-TOF spolu s BioConfirm softwarem představuje komplexní a flexibilní platformu pro detailní charakterizaci semaglutidu a obdobných terapeutických peptidů. Díky orthogonálnímu separačnímu přístupu, multi-injection MHC a vysoce senzitivnímu Q-TOF MS lze odhalit i velmi nízkonadějné nečistoty a fragmenty s vysokou přesností a reprodukovatelností. Metoda nachází využití v rámci QA/QC, farmaceutického vývoje a garantování bezpečnosti peptidových léčiv.

Reference

1. Singh S. et al. PEPstrMOD: Structure Prediction of Peptides Containing Natural, Non-Natural and Modified Residues. Biol. Direct. 2015, 10, 73.
2. D’Hondt M. et al. Related Impurities in Peptide Medicines. J. Pharm. Biomed. Anal. 2014, 101, 2–30.
3. Zhang B. et al. Characterization of Low Level D-Amino Acid Isomeric Impurities of Semaglutide Using LC-HRMS/MS. J. Pharm. Biomed. Anal. 2023, 224, 115164.
4. Latif W. et al. Compare and Contrast the Glucagon-Like Peptide-1 Receptor Agonists (GLP1RAs). StatPearls. 2024.
5. Buckenmaier S.; Petersson P. Analysis of Peptide/Protein-Related Impurities Using Integrated Bio 2D-LC/Q-TOF in Agilent MassHunter. 2024.
6. Ahmad S. et al. LC/MS-Based Characterization Workflow of Liraglutide and Its Impurities. Agilent application note 5994-7727EN, 2024.