Analysis of Polar and Ionic Drugs in Doping Control by Ion‑Exchange Chromatography with the Agilent 1260 Infinity II SFC System

Význam tématu

Analýza vysoce polárních a iontových látek je v dopingové kontrole a forenzní toxikologii klíčová pro detekci látek, které se obtížně separují klasickou HPLC. Superkritická fluidní chromatografie (SFC) ve spojení s iontovou výměnnou chromatografií přináší vyšší selektivitu, kratší doby analýzy a spolehlivou kvantifikaci.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a optimalizovat SFC/MS/MS metodu na systému Agilent 1260 Infinity II pro separaci a kvantifikaci polárních a iontových drog a jejich metabolitů relevantních pro dopingovou kontrolu. Studie zahrnovala výběr kolony, optimalizaci mobilní fáze, gradientu, teploty, přetlaku a MS podmínek, následné ověření analytických parametrů a porovnání s existujícími HPLC metodami.

Použitá metodika a instrumentace

Instrumentace:

• Agilent 1260 Infinity II SFC System (Control Module, Binary Pump, Multisampler, Diode Array Detector s vysokotlakou SFC kyvetou, Multicolumn Thermostat).
• Agilent 6470A Triple Quadrupole LC/MS s technologií Jet Stream.
• Silika-bazovaná SCX kolona modifikovaná sulfonovými skupinami (4,6×150 mm, 5 µm).

Metodika:

• Mobilní fáze: CO2 + MeOH/H2O (95/5, v/v) s 20 mM ammonium formiátu a 15 mM kyseliny mravenčí.
• Gradient: 15–60 % modifieru v 1 min s přechodem průtoku z 2,0 na 2,5 mL/min, post-time 2 min.
• Teplota kolony 45 °C, backpressure 170 bar, injekce 2 µL, ESI+/- režimy.
• Příprava vzorku moči: proteinhleresce MeOH, centrifugace a ředění 1:10.

Hlavní výsledky a diskuse

• Optimalizovaná metoda umožňuje separaci GBL, GHB, ETS, ETG, GHB-Gluc, Meldonium a G-BTB s retencemi 1,3–3,4 min.
• Lokální matice nepřináší interferenční signály pro většinu analyzovaných přechodů, jedině minimální potlačení nebo zvýšení signálu u ETG, GHB-Gluc, ETS a G-BTB.
• Limit detekce u ETS a Meldonium dosahuje 0,001 mg/L a LOQ 0,005 mg/L, pro ostatní látky LOQ odpovídají požadavkům MRPL a cut-off hodnotám v dopingové kontrole.
• Přesnost ploch píků CV 2–13 %, stabilita retenčních časů CV <1 %, linearita R2 >0,97.

Přínosy a praktické využití metody

• Rychlá a selektivní alternativa k HPLC/MS/MS pro polární a iontové látky.
• Schopnost kvantifikovat analyty v lidské moči pod úrovní stanovených hranic pro dopingovou a forenzní praxi.
• Odolnost kolony vůči blokování a jednoduchá příprava vzorků.

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření aplikace SFC pro další třídy látek (peptidy, lékové metabolity).
• Automatizace přípravy vzorků a vysokoproduktivní platformy pro rutinní testování.
• Optimalizace složení modifieru a přísad pro širší lineární rozsahy a minimalizaci matice.
• Využití vysoce rozlišovací MS pro potvrzování neznámých látek.

Závěr

Vyvinutá SFC metoda na Agilent 1260 Infinity II poskytuje spolehlivou, citlivou a rychlou analýzu vysoce polárních a iontových drog a metabolitů v moči. Metoda představuje perspektivní alternativu k tradičním HPLC/MS postupům pro dopingovou kontrolu a forenzní toxikologii.

Reference

1. Par MK, et al. SFC/MS as an Orthogonal Technique for Improved Screening of Polar Analytes in Anti-Doping Control. Anal Bioanal Chem. 2016;408:6789–6797.
2. Desfontaine V, et al. SFC–MS Versus RPLC-MS for Drug Analysis in Biological Samples. Bioanalysis. 2015;7:1193–1195.
3. Fujito Y, et al. Importance of Optimizing Chromatographic Conditions and Mass Spectrometric Parameters for Supercritical Fluid Chromatography/Mass Spectrometry. J Chromatogr A. 2017;1508:138–147.
4. Novakova L, et al. UHPSFC-MS/MS for Screening of Doping Agents: Analysis of Biological Samples. Anal Chim Acta. 2015;853:647–659.
5. Abanades S, et al. Gamma-Hydroxybutyrate (GHB) in Humans: Pharmacodynamics and Pharmacokinetics. Ann NY Acad Sci. 2006;1074:559–576.
6. Mehling LM, et al. GHB-O-β-Glucuronide in Blood and Urine: Extension of Detection Window After GHB Intake. Forensic Toxicol. 2017;35:263–274.
7. Xhaferaj M, et al. Ion Exchange in SFC-MS/MS: Application of Polar and Ionic Drugs and Metabolites in Forensic and Anti-Doping Control. J Chromatogr A. 2020;1614:460726.
8. Albertmann M, et al. HPLC-MS/MS Method for Ethyl Glucuronide and Ethyl Sulfate in Urine According to Forensic Guidelines. J Chromatogr Sci. 2012;50:51–56.
9. Kim Y, et al. Screening and Confirming Meldonium in Human Urine by High-Resolution Mass Spectrometry. Mass Spectrom Lett. 2017;8:39–43.
10. WADA. Technical Document TD2016EAAS. 2015.
11. Brailsford AD, et al. Pharmacokinetic Properties of GHB in Whole Blood, Serum and Urine. J Anal Toxicol. 2012;36:88–95.
12. WADA. TD2018MRPL. 2018.