Flexible HPLC instrument setups for double usage as one heart-cut-2D-LC system or two independent 1D-LC systems

Význam tématu

Jednorozměrná kapalinová chromatografie (1D-LC) často nedostačuje pro situace, kdy je zapotřebí rozlišit podobné či izomerické sloučeniny a současně potvrdit jejich identitu hmotnostní spektrometrií (MS). Problém představují nevolatilní pufry v mobilních fázích 1D-LC-UV metod, které komplikují přímé MS detekční kroky. Heart-cut 2D-LC s redukcí eluační síly využívá selektivní přenos úzkého frakčního pásma z první dimenze (1D) do druhé dimenze (2D) se zředěním eluční fáze a zachycením na past-column či trapu, čímž se minimalizuje vliv silných organických či solných fragm entů a umožní se efektivní 2D-MS analýza.

Cíle a přehled studie

Autoři práce M. Grübner a G. Greco představují několik flexibilních konfigurací heart-cut 2D-LC založených na platformě Thermo Scientific Vanquish UHPLC. Studie porovnává čtyři fluidické sestavy (označené jako setupy 1a, 1b, 2 a 3) z hlediska chromatografického výkonu, použitelnosti, možnosti rozděleného provozu jako dvě nezávislé 1D-LC cesty a schopnosti jednoduchého přepínání mezi režimem 2D-LC a dual 1D-LC bez manuálních úprav.

Použitá metodika a instrumentace

Metodika spočívá ve vykreslení frakce úzkého pásma z 1D-LC-UV metody se silným elučním činidlem do trupu vody z 2D-pumpy za zvýšeného průtoku a zachycení na trap-column či přímo na hlavě 2D-kolony. Následuje výměna ventilů, zpětné proplachování a analýza v 2D-LC-MS s gradienty a podmínkami uvedenými v tabulkách 1–3. Jako modelové sloučeniny byly použity izomerické agrochemikálie desmedipham a phenmedipham.

Instrumentace:

• UHPLC platforma Thermo Scientific Vanquish Flex s quaternární i binární pumpou
• Vanquish Split Sampler FT nebo Vanquish Dual Split Sampler FT
• Více pozicové 6portové ventily pro heart-cut i přesměrování toku
• Trap-column Chromeleon Workflow Kit pro online 2D-LC
• Detektory UV (DAD a VWD) a hmotnostní spektrometr Thermo Scientific Q Exactive Plus
• Řídicí software Chromeleon CDS 7.2.9, Xcalibur 4.0/SII nebo Empower/SII

Hlavní výsledky a diskuse

Všechny čtyři fluidické konfigurace umožnily kvantitativní přenos peaků z 1D do 2D bez významných odchylek v plochách a šířkách. Setupy 1a a 1b využívají externí trap-column, setup 2 zachycuje přímo na hlavě 2D-kolony a setup 3 kombinuje obě výhody a přidává třetí ventil a druhý compartment pro nastavení odlišných teplot. Setup 3 se ukázal jako nejflexibilnější, umožňuje plynulé přepínání mezi jednou 2D-LC cestou a dvěma nezávislými 1D-LC cestami bez jakéhokoliv přeplňování přístroje či manuálních zásahů.

Přínosy a praktické využití metody

• Přímé potvrzení identity a čistoty analytu MS detekcí bez úprav původní 1D-UV metody
• Redukce času a dokumentačních nároků v regulovaných laboratořích
• Optimalizované využití LC i MS detektorů, vyšší návratnost investic (ROI)
• Možnost provádět paralelní 1D-LC analýzy při nečinnosti 2D dimenze
• Nastavení pracovních postupů (workflows) včetně vnitrního standardu, IRC ve Chromeleonu

Budoucí trendy a možnosti využití

• Rozšíření na multi-heart-cut a plně komplexní 2D-LC pro vysoce složité matrice
• Automatizované šablony metod s inteligentním řízením (IRC) pro různé frakční okna
• Integrace s dalšími detekčními technikami (např. NMR, fluorescence)
• Pokročilé fluidické konstrukce pro realtime módy a on-the-fly přepínání

Závěr

Heart-cut 2D-LC s eluační redukcí a zachycením na trap-column ukazuje vysokou robustnost, reprodukovatelnost a flexibilitu. Nejvýhodnější konfigurace s Vanquish Dual Split Sampler (setup 3) minimalizují riziko chyb, umožňují nastavit různé provozní teploty, snadno přepínají mezi režimy 1D a 2D bez přebudování a maximálně využívají kapacity LC-MS přístroje.

Reference

1. Guiochon G. The limits of the separation power of unidimensional column liquid chromatography, J Chrom A 2006, 1126, 6–49
2. Guiochon G et al. Implementations of two-dimensional liquid chromatography, J Chrom A 2008, 119, 109–168
3. Grübner M, Steiner F. Complementary Dual LC as a convenient alternative to multiple heart-cut 2D-LC for samples of medium complexity, Thermo Fisher Scientific Technical Note 73184, 2019
4. Stoll DR, Carr PW. Two-dimensional liquid chromatography: A state of the art tutorial, Anal Chem 2017, 89, 519–531
5. Petersson P, Haselmann K, Buckenmaier S. Multiple heart-cutting two dimensional liquid chromatography mass spectrometry: Towards real time determination of related impurities of bio-pharmaceuticals in salt based separation methods, J Chrom A 2016, 1468, 95–101
6. Stoll DR et al. Evaluation of detection sensitivity in comprehensive two-dimensional liquid chromatography separations of an active pharmaceutical ingredient and its degradants, Anal Bioanal Chem 2015, 407, 265–277