High Resolution Size-Exclusion Chromatography Separations of mAb Aggregates, Monomers, and Fragments using BioResolve SEC mAb Columns on UPLC, UHPLC, and HPLC Chromatography Systems

Význam tématu

Kontrola kvality mAb bioterapeutik je klíčová, protože přítomnost agregátů, monomerů a fragmentů ovlivňuje bezpečnost a účinnost léčby. Aqueous SEC je standardní metodou pro relativní kvantifikaci různých molekulárních forem bílkovin v ne-denaturujících podmínkách. Moderní sloupce s jemným plnivem a optimalizované chromatografické systémy umožňují lepší oddělení fragmentů o velikosti podobné monomeru (~100 kDa) a agregátů (>300 kDa).

Cíle a přehled studie / článku

Cílem práce bylo ověřit výkon nových BioResolve SEC mAb 200 Å, 2,5 µm kolonek o vnitřním průměru 7,8 mm a 4,6 mm a délkách 150 mm a 300 mm na platformách UPLC, UHPLC a HPLC. Pomocí standardu založeného na NISTmAb s přidanými IdeS fragmenty byla hodnocena schopnost separovat a kvantifikovat mAb agregáty, monomer a fragmenty při různých úrovních systému rozptylu.

Použitá metodika a instrumentace

• Chromatografické systémy: ACQUITY UPLC H-Class Bio (5σec = 10–13 µL), ACQUITY Arc Bio (30 µL), Alliance HPLC (49 µL).
• Kolonky BioResolve SEC mAb, 200 Å, 2,5 µm: 7.8 × 300 mm, 7.8 × 150 mm, 4.6 × 300 mm, 4.6 × 150 mm.
• Mobilní fáze: 50 mM fosfátový pufr pH ~7 s 200 mM KCl, voda, 10 % acetonitril v modifikovaném pufru.
• Detekce: UV detektor při 280 nm.
• Standard: 160 µg NISTmAb RM8671 + 2 µg IdeS fragmentů (F(ab’)2 a (Fc/2)2) ve 70 µL vody.
• Měření rozptylu: 5σec pomocí roztoku kofeinu (0,5 µL injekce).

Hlavní výsledky a diskuse

• 7,8 mm I.D. kolony nabízejí nejvyšší rozlišení i při vyšší disperzi systému. Oddělují agregáty, monomer (~150 kDa) a Fab/c fragment (~100 kDa) napříč UPLC, UHPLC a HPLC.
• 4,6 mm I.D. kolony dosahují srovnatelné kvality na UPLC systémech, ale vykazují větší ztrátu rozlišení fragmentů při vyšší disperzi (UHPLC, HPLC).
• 300 mm délka poskytuje vyšší efektivitu a p/v poměr pro fragmenty (>2) než 150 mm sloupce, zejména u systémů s nízkou disperzí.
• Hlavní šířka pásma (5σec) a faktory roztažení mají přímý vliv na počet terčů a kvalitu separace fragmentů.
• Kvantitativní metriky: USP rozlišení pro dimery/monomer, p/v poměr pro LMWS fragmenty.

Přínosy a praktické využití metody

• Individuálně testované kolony zajišťují spolehlivost out-of-the-box pro QC analýzy mAb.
• Volba mezi 7,8 mm I.D. (maximální rozlišení) a 4,6 mm I.D. (ekonomičtější provoz, nižší spotřeba vzorku a eluční fáze).
• Flexibilní nasazení na různých chromatografických platformách bez nutnosti úprav systému.

Budoucí trendy a možnosti využití

Vývoj směřuje k dalšímu snižování extra-column disperze (úprava tubing, minimalizace mrtvého objemu) a k inovacím plniv pro vyšší selektivitu a stabilitu. Kombinace SEC s více dimenzionálními technikami (LC-MS, IF-LC) rozšíří charakterizaci mAb.

Závěr

BioResolve SEC mAb kolony nabízejí robustní a reprodukovatelné oddělení mAb agregátů, monomerů a fragmentů. Správná volba I.D. a délky kolony ve spojení s disperzními vlastnostmi systému je klíčová pro QC i výzkum.

Reference

1. Hong P., Koza S., Bouvier E.S. Size-Exclusion Chromatography for the Analysis of Protein Biotherapeutics and their Aggregates. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2012, 35, 2923–2950.
2. Cordoba A.J., Shyong B.J., Breen D., Harris R.J. Non-Enzymatic Hinge Region Fragmentation of Antibodies in Solution. J. Chromatogr., B. 2005, 818, 115–12.
3. Koza S.M., Chen W. High Resolution and High Throughput Size-Exclusion Chromatography Separations of IgG Antibody Aggregates and Fragments on UHPLC and HPLC Systems with 2.5 μm BEH Particles. Waters Application Note, 720006522EN, 2019.
4. Koza S.M., Reed C.E., Chen W. Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Monoclonal IgG Antibody Aggregates and Fragments. Waters Application Note, 720006336EN, 2019.
5. Koza S.M., Reed C.E., Chen W. Evaluating the Impact of LC System Dispersion on the Size-Exclusion Chromatography Analysis of Proteins. Waters Application Note, 720006337EN, 2019.
6. USP43-NF39, Insulin Monograph. Pharmacopoeial Forum, 2016.
7. Fekete S., Guillarme D. Influence of Connection Tubing in Modern Size Exclusion Chromatography. J. Pharm. Biomed. Anal. 2018, 149, 22–32.