High-Sensitivity Analysis of Drugs in Ultra-Small Volume Plasma Samples Using Microflow LC/MS/MS

Význam tématu

Vývoj vysoce citlivých metod LC/MS/MS v mikroproudu je klíčový pro farmakokinetické studie, kde jsou k dispozici velmi malé objemy biologických vzorků.
Miniaturizace analytických metod snižuje počet zvířat a objem potřebné krve, čímž zvyšuje etickou a ekonomickou efektivitu výzkumu.

Cíle a přehled studie / článku

Cílem studie bylo demonstrovat vysokocitlivou analýzu léčiv a jejich metabolitů ve vzorcích plasmy o objemu pouhých 2 μL.
Práce popisuje využití mikroproudového LC/MS/MS systému Shimadzu Nexera Mikros se schopností trap & elute injekce pro zlepšení tvaru píku a zvýšení citlivosti.

Použitá metodika a instrumentace

• Shimadzu Nexera Mikros mikroproudové kapalinové chromatografické uspořádání (1–500 μL/min) spojené s hmotnostním spektrometrem LCMS-8060 a mikro-ESI zdrojem pro ionizaci při 2,6 kV.
• Trap & elute injekce: retence analytů na trap kolonce Shim-pack MCT LC8 (5 mm × 0,3 mm, 5 μm) a následné přesměrování analytické fáze na kolonu Shim-pack MC PLONAS Biphenyl (100 mm × 0,2 mm, 2,7 μm) při 4 μL/min.
• Příprava vzorku: 2 μL plasmy doplněné o Verapamil, Nor-verapamil a interní standard Verapamil-D6, deproteinace acetonitrilem s 0,1% kyselinou mravenčí, odstředění a injekce 5 μL supernatantu.
• Chromatografické podmínky: gradient od 26 % do 95 % acetonitrilu (oba s 0,1 % HCOOH) v čase 1–5 min při 40 °C.
• Detekce MRM: optimalizované přechody pro Verapamil (455→150, 455→303), Nor-verapamil (441→165, 441→150) a standard Verapamil-D6 (461→309, 461→165).

Hlavní výsledky a diskuse

• Použitím mikroproudu došlo ke 4,5× vyšší signální intenzitě Verapamilu a 3,5× u Nor-verapamilu oproti semi-mikroproudové metodě při stejném objemu vzorku.
• Kalibrační křivky vykázaly lineární odezvu R²≥0,998 a přesnost v rozmezí 94–110 % pro oba analyty.
• Metoda umožňuje zachovat analytické parametry i při významném snížení spotřeby vzorku na pouhé 2 μL plasmy.

Přínosy a praktické využití metody

• Snížení etické zátěže a nákladů díky minimálnímu odběru vzorku.
• Vysoká robustnost a kratší doby analýzy podporují efektivitu vývoje léčiv.
• Vhodné pro předklinické i klinické farmakokinetické studie vyžadující měření nízkých koncentrací léčiv a metabolitů.

Budoucí trendy a možnosti využití

Další vývoj směřuje k další miniaturizaci, automatizaci a integraci s on-line vzorkováním.
Očekává se rozšíření využití v biomarkerových a multiplexních analýzách, PK/PD modelování a využití pokročilých výpočetních nástrojů pro zpracování dat.

Závěr

Mikroproudové LC/MS/MS s trap & elute přístupem významně zvyšuje citlivost analýzy a umožňuje detekci léčiv v ultra-malých objemech plasmy při zachování přesnosti, lineárnosti i robustnosti metody.
Tato technologie je perspektivní volbou pro rané fáze vývoje léčiv a farmakokinetické studie.

Reference

1. Rapid Commun. Mass Spectrom. 2014, 28, 1293–1302.