Microflow LC-MS/MS Analysis of Monoclonal Antibody in Human Plasma at ng/mL Level with nSMOLTM Proteolysis

Význam tématu

Stanovení terapeutických monoklonálních protilátek v lidské plazmě pomocí LC-MS/MS je nezbytné pro farmakokinetické studie a monitorování účinnosti léčiv. Kombinace nanostrukturované orientačně omezené proteolýzy nSMOL a mikroflow chromatografie umožňuje dosáhnout vysoké specificity i citlivosti, zjednodušit přípravu vzorků a zkrátit dobu analýz.

Cíle a přehled studie

Cílem studie bylo vyvinout a validovat bioanalytickou metodu pro měření Trastuzumabu v lidské plazmě s dosažením rozsahu nízkých ng/mL. Autoři porovnali klasickou semi-microflow konfiguraci se systémem Nexera MikrosTM pro zvýšení citlivosti při zachování robustnosti a rychlosti analýzy.

Použitá metodika a instrumentace

Vzorky lidské plazmy s různými koncentracemi Trastuzumabu byly upraveny pomocí nSMOL Antibody BA kitu. Proteolýza probíhala na FG kuličkách s proteázou v saturated vapor podmínkách. Po digesci byly CDR peptidy přeneseny do LC-MS/MS.

Použitá instrumentace

• Chromatografický systém Nexera MikrosTM s mikroflow čerpadlem (4 μl/min) a kolonkou Shim-Pack MC C18 (50×0,175 mm)
• Trap kolonka L-column 2 ODS Micro (5×0,3 mm)
• Hmotnostní spektrometr LCMS-8060 s mikro-ESI zdrojem
• nSMOL Antibody BA Kit (Shimadzu) a FG beads Trypsin DART

Hlavní výsledky a diskuse

Metoda prokázala lineární odezvu mezi 7,6 ng/ml až 62,5 μg/ml s LLOQ 7,6 ng/ml, což představuje přibližně jedno řádové zvýšení citlivosti oproti dřívější konfiguraci (LLOQ 0,06 μg/ml). Opakovatelnost (RSD) a přesnost (Recovery) pro QC úrovně vykázaly hodnoty pod 12 %. Chromatogramy potvrdily čistotu CDR peptidů a nízkou úroveň šumu.

Přínosy a praktické využití metody

• Vysoká citlivost pro farmakokinetické studie i klinický monitoring
• Standardizovaná a rychlá příprava vzorků pomocí nSMOL
• Robustnost a snadná konfigurace mikroflow LC-MS/MS systému
• Minimalizace interference biologické matrice

Budoucí trendy a možnosti využití

Očekává se další zlepšení citlivosti díky optimalizaci ionizačních podmínek a pokročilým mikrofluidním designům. Integrace automatizované přípravy vzorků a vysokopropustné workflow podpoří rozsáhlé farmacokinetické studie a personalizovanou medicínu. Využití nSMOL pro jiné třídy biologik a multiplexní analýzy je dalším perspektivním směrem.

Závěr

Implementace mikroflow LC-MS/MS se systémem Nexera Mikros a nSMOL proteolýzou umožnila citlivé, přesné a opakovatelné stanovení Trastuzumabu v lidské plazmě na úrovni jednotek ng/ml. Metoda nabízí rychlé nasazení a vysokou robustnost, což z ní činí cenný nástroj pro bioanalýzu terapeutických protilátek.

Reference

• Iwamoto N et al., Analyst, DOI:10.1039/c3an02104a
• Iwamoto N et al., Anal Methods, DOI:10.1039/c5ay01588j
• Iwamoto N et al., Application News No.C145A